Forbigående Expression og cellulær lokalisering av rekombinante proteiner i dyrkede insektceller

Summary

Nonlytic insektcelle-ekspresjonssystemer er underutnyttet for produksjon, cellulær handel / lokalisering, og rekombinant protein funksjonell analyse. Her beskriver vi metoder for å generere ekspresjonsvektorer og påfølgende forbigående proteinekspresjon i kommersielt tilgjengelige sommerfugl-cellelinjer. Den ko-lokalisering av Bemisia tabaci aquaporins med subcellulære fluorescerende markørproteiner er også presentert.

Abstract

Heterologe proteiner ekspresjonssystemer brukes for fremstilling av rekombinante proteiner, tolkningen av cellulær handel / lokalisering, og bestemmelse av den biokjemiske funksjon av proteiner ved under eller organismen. Selv om baculovirus ekspresjons-systemer blir stadig mer brukt for proteinproduksjon i mange bioteknologisk, farmasøytiske og industrielle anvendelser, nonlytic systemer som ikke involverer viral infeksjon har klare fordeler, men er ofte overses og lite brukte. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å generere nonlytic ekspresjonsvektorer og forbigående ekspresjon av rekombinant protein. Denne protokollen gir mulighet for effektiv cellulær lokalisering av rekombinante proteiner og kan brukes til hurtig å skjelne protein handelen i cellen. Vi viser ekspresjonen av fire rekombinante proteiner i en kommersielt tilgjengelig insekt-cellelinje med to aquaporin proteiner fra det insekt Bemisia tabaci, så velsom subcellulære markørproteiner som er spesifikke for celleplasmamembranen og intracellulære lysosomer. Alle rekombinante proteiner ble produsert som kimærer med fluorescerende protein markører på sin karboksyl termini, som gjør det mulig for den direkte påvisning av de rekombinante proteiner. Den doble transfeksjon av celler med plasmider som husing konstruksjoner for gener av interesse og en kjent subcellulær markør tillater levende celle avbildning og forbedret verdsetting av cellulært protein lokalisering.

Introduction

Fremstilling av rekombinante proteiner ved anvendelse av insektcelle-ekspresjonssystemer gir en rekke fordeler for studiet av eukaryote proteiner. Nemlig, insektceller har lignende post-translasjonelle modifikasjoner, behandling, sortering og mekanismer som de som er til stede i pattedyrceller, som er fordelaktig for fremstilling av korrekt foldete proteiner ^{1, 2, 3.} Insektcellesystemer inkluderer også typisk mindre ressurskrevende og mindre tid og anstrengelse for vedlikehold enn pattedyrcellelinjer ^{4, 5.} Baculovirus-ekspresjonssystemet er et slikt insektcelle-basert system som nå mye brukt i mange fagområder, inkludert produksjon av rekombinante proteiner for proteinkarakterisering og terapeutika, det immunogene presentasjonen av fremmede peptider og virale proteiner for vaksineproduksjon, syntesen av fler -protein-komplekser, Produksjon av glykosylerte proteiner, osv. ^{1, 2, 4, 6.} Det finnes imidlertid situasjoner hvor baculovirus ekspresjon kan ikke være relevant ^{3, 7,} og bruken av nonlytic og forbigående insekt ekspresjonssystemer kan være mer hensiktsmessig. Nærmere bestemt, har transient insektcelle ekspresjon mulighet for hurtig syntese av rekombinant protein, krever mindre utvikling og vedlikehold, innebærer ikke viral pålagt cellelyse, og gir et middel for å bedre studere cellulært handelen under proteinsyntesen ^{7, 8, 9, 10.}

Denne protokollen beskriver den hurtige dannelse av ekspresjonsvektorer ved bruk av to-trinns overlappforlengelse-PCR (OE-PCR) <sup class = "ekstern referanse"> 11 og standard kloning av plasmid-DNA i Escherichia coli. Plasmider blir brukt til å transfektere dobbelt kommersielt tilgjengelige dyrkede insektceller og for å fremstille representative proteiner. Protokollen beskriver fremstilling og bruk av to forskjellige fluoresceinmerkede subcellulære markørproteiner og demonstrerer colocalization med to aquaporin proteiner fra det insekt Bemisia tabaci. Følgende protokoll gir grunnleggende metodikk for OE-PCR, insektcelle vedlikehold og transfeksjon, og fluorescens mikroskopi for den cellulære lokalisering av målproteiner.

Protocol

1. OE-PCR for konstruksjonen av ekspresjonsplasmider Merk: Se tabell 1 for alle primere som brukes i OE-PCR. Bruken av en Hi-Fi-DNA-polymerase er anbefalt for alle amplifikasjoner. Imidlertid, fordi disse enzymer ofte ikke gitt noen 3' A, er det nødvendig å utføre en kort, ikke-amplifisering inkubasjon med en Taq DNA-polymerase for å 'A-hale' som PCR-produktene før kloning dem inn i en TA-insektcelle ekspresjon vektor. Denne protokollen viser en metode for å …

Representative Results

OE-PCR OE-PCR gjør det mulig for syntese av chimeriske DNA-produkter som, når de settes inn i en ekspresjonsvektor, tillate produksjon av rekombinante kimære proteiner som korresponderer til et hvilket som helst test genet av interesse og fluorescerende markørprotein. Figur 1 viser et generelt skjema for fremstilling av PIB-ekspresjonsvektorer inneholdende B. tabaci aquaporin kodende sekvenser (BtDri…

Discussion

Heterologe protein ekspresjonssystemer er viktige verktøy for produksjon av rekombinante proteiner som benyttes i tallrike anvendelser nedstrøms ^4. Velge fra de ulike uttrykks systemer tilgjengelig, avhenger av det endelige målet for proteinet av interesse. Flere insektscelle-ekspresjonssystemer er tilgjengelige som gir bøyelige alternativer til prokaryote og eukaryote celleekspresjonsvektorer systemer ^{5, 6.} Insektsystemer som krever …

Materials

KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605