Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Summary

sistemas de expressão em células de insecto Nonlytic são pouco utilizados para a produção, o tráfico celular / localização, e a análise funcional da proteína recombinante. Aqui, nós descrevemos métodos para gerar vectores de express e subsequente expressão da proteína transiente em linhas de células de lepidópteros disponíveis comercialmente. A co-localizao de aquaporinas de Bemisia tabaci com proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares também é apresentada.

Abstract

sistemas de expressão de proteínas heterólogas são utilizados para a produção de proteínas recombinantes, a interpretação de tráfico celular / localização, e a determinação da função bioquímica de proteínas ao nível sub-organismos. Embora os sistemas de baculovírus de expressão são cada vez mais utilizados para a produção de proteína em numerosos biotecnológica, farmacêutica e aplicações industriais, sistemas nonlytic que não envolvem infecção viral tem benefícios claros, mas muitas vezes são esquecidos e subutilizados. Aqui, descrevemos um método para a geração de vectores de expressão nonlytic e a expressão da proteína recombinante transiente. Este protocolo permite a localização celular eficiente de proteínas recombinantes e pode ser utilizado para discernir rapidamente proteína tráfico dentro da célula. Mostramos a expressão de quatro proteínas recombinantes em uma linha celular de insecto disponível comercialmente, incluindo duas proteínas aquaporina do Bemisia tabaci insectos, bemcomo proteínas marcadoras subcelulares específicos para a membrana plasmática da célula e para os lisossomas intracelulares. Todas as proteínas recombinantes foram produzidas como quimeras com marcadores de proteínas fluorescentes nas suas extremidades carboxilo, que permite a detecção directa das proteínas recombinantes. A dupla transfecção das células com plasmeos albergando construes para os genes de interesse e um marcador subcelular conhecido permite imagens de células vivas e melhorada validação de localização da proteína celular.

Introduction

A produção de proteínas recombinantes, utilizando sistemas de expressão de células de insecto oferece numerosos benefícios para o estudo de proteínas eucarióticas. Ou seja, as células de insectos possuir modificações semelhantes pós-tradução, processamento, e os mecanismos de triagem como os presentes em células de mamíferos, o que é vantajoso para a produção de proteínas correctamente dobradas ^{1, 2, 3.} Sistemas de células de insectos também tipicamente requerem menos recursos e menos tempo e esforço para manutenção de linhas celulares de mamíferos ^{4, 5.} O sistema de expressão de baculovírus é um tal sistema baseado em células de insecto que é agora amplamente utilizados em muitas disciplinas, incluindo a produção de proteínas recombinantes para caracterização da proteína e terapêutica, a apresentação imunogénica de peptídeos estranhos e proteínas virais para produção de vacinas, a síntese de múltiplas -proteína complexos, A produção de proteínas glicosiladas, etc. ^{1, 2, 4, 6.} Existem, no entanto, situações em que a expressão de baculovírus pode não ser aplicável ^{3, 7,} e a utilização de sistemas de expressão de insectos e nonlytic transientes podem ser mais apropriados. Especificamente, a expressão de células de insecto transiente oferece a possibilidade para a rápida síntese de proteína recombinante, requer menos desenvolvimento e manutenção, não envolve a lise celular viral-impostas, e fornece um meio para melhor estudar o tráfico celular durante a síntese ^{7, 8, 9, proteína, 10.}

Este protocolo descreve a rápida geração de vectores de expressão utilizando duas etapas de PCR de extensão de sobreposição (OE-PCR) <sup classe = "refex"> 11 e o padrão de clonagem de ADN de plasmídeo em Escherichia coli. Os plasmídeos são usados ​​para transfectar células de duplo de insecto em cultura disponíveis comercialmente e para produzir proteas representativas. O protocolo descreve a produção e utilização de duas proteínas marcadoras subcelular fluorescentemente marcadas diferentes e demonstra uma co-localização com duas proteínas aquaporina do Bemisia tabaci inseto. O protocolo seguinte fornece a metodologia básica para OE-PCR, a manutenção de células de insectos e de transfecção, e a microscopia de fluorescência para a localização celular de proteínas alvo.

Protocol

1. OE-PCR para a construção de plasmídeos de expressão Nota: Ver Tabela 1 para todos os iniciadores utilizados na OE-PCR. A utilização de uma polimerase de DNA de alta-fidelidade é recomendada para todas as amplificações. No entanto, porque estas enzimas frequentemente não deixe um 3' , é necessário realizar uma breve, a incubação não-amplificação com uma polimerase de ADN de Taq a 'um-cauda' produtos do PCR antes da clonagem-los em uma expressão …

Representative Results

OE-PCR OE-PCR permite a síntese de produtos de ADN quiméricas que, uma vez inserida num vector de expressão, para permitir a produção de proteínas quiméricas recombinantes correspondentes a qualquer gene de teste de interesse e proteína marcador fluorescente. A Figura 1 representa um esquema geral para a produção de vectores de expressão contendo PIB B. sequências de codificação (BtDrip1 e …

Discussion

Sistemas de expressão de proteínas heterólogas são ferramentas importantes para a produção de proteínas recombinantes utilizadas em numerosas aplicações a jusante ^4. Escolhendo a partir de diversos sistemas de expressão disponíveis depende do objectivo final para a proteína de interesse. Vários sistemas de expressão em células de insecto estão disponíveis que oferecem alternativas flexíveis para sistemas de expressão de células procariotas e eucariotas ^5…

Materials

KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605