Icke-lytisk insektscellexpressionssystem är underutnyttjade för tillverkning, cellulär trafficking / lokalisering, och rekombinant protein funktionell analys. Här beskriver vi metoder för att generera expressionsvektorer och efterföljande övergående proteinuttryck i kommersiellt tillgängliga ordningen fjärilar cellinjer. Co-lokalisering av Bemisia tabaci aquaporiner med subcellulära fluorescerande markörproteiner presenteras också.
Heterologa proteinexpressionssystem används för produktion av rekombinanta proteiner, tolkningen av cellulära trafficking / lokalisering, och bestämningen av den biokemiska funktionen hos proteiner på sub-organismnivå. Även baculovirus expressionssystem används alltmer för proteinproduktion i många biotekniska, läkemedels- och industriella tillämpningar, icke-lytisk system som inte involverar virusinfektion har klara fördelar, men är ofta förbisedd och underutnyttjade. Här beskriver vi en metod för att generera icke-lytisk expressionsvektorer och transient uttryck av rekombinant protein. Detta protokoll möjliggör effektiv cellulära lokaliseringen av rekombinanta proteiner och kan användas för att snabbt urskilja protein trafficking inom cellen. Vi visar uttrycket av fyra rekombinanta proteiner i en kommersiellt tillgänglig insektscellinje, däribland två aquaporin proteiner från insekten Bemisia tabaci, samtsom subcellulära markörproteiner som är specifika för cellplasmamembranet och för intracellulära lysosomer. Alla rekombinanta proteiner producerades som chimärer med fluorescerande proteinmarkörer vid deras karboxyl-termini, vilket möjliggör direkt detektion av de rekombinanta proteinerna. Den dubbla transfektion av celler med plasmider som härbärgerar konstruktioner för generna av intresse och en känd subcellulär markör möjliggör levande cell imaging och förbättrad validering av cellulär proteinlokalisering.
Produktionen av rekombinanta proteiner med hjälp av insektscellexpressionssystem erbjuder många fördelar för studier av eukaryota proteiner. Nämligen, insektsceller har liknande posttranslationella modifieringar, bearbetning, och sorteringsmekanismer som de som förekommer i däggdjursceller, vilket är fördelaktigt för framställning av korrekt veckade proteiner 1, 2, 3. Insektcellsystem kan ofta också kräver mindre resurser och mindre tid och ansträngning för underhåll än däggdjurscellinjer 4, 5. Baculovirusexpressionssystemet är ett sådant insektscellbaserat system som nu används i stor utsträckning i många discipliner, inklusive produktion av rekombinanta proteiner för proteinkarakterisering och terapeutika, den immunogena presentation av främmande peptider och virala proteiner för vaccinproduktion, syntesen av multi Protein komplex, Produktion av glykosylerade proteiner, osv. 1, 2, 4, 6. Det finns dock situationer där baculovirus-expressions kanske inte är tillämplig 3, 7, och användningen av icke-lytisk och transienta insektsexpressionssystem kan vara mer lämpligt. Specifikt, erbjuder transient insektscelluttryck möjligheten för snabb syntes av rekombinant protein, kräver mindre utveckling och underhåll, inte involverar virala pålagda cellys, och tillhandahåller ett medel för att bättre studera cellulärt trafficking under proteinsyntes 7, 8, 9, 10.
Detta protokoll beskriver den snabba alstringen av expressionsvektorer med användning av två steg överlappande extensions-PCR (OE-PCR) <sup class = "xref"> 11 och standard kloning av plasmid-DNA i Escherichia coli. Plasmider används för att dubbel transfektera kommersiellt tillgängliga odlade insektsceller och för att framställa representativa proteiner. Protokollet beskriver produktionen och användningen av två olika fluorescensmärkta subcellulära markörproteiner och visar samlokalisering med två aquaporin proteiner från insekten Bemisia tabaci. Följande protokoll tillhandahåller den grundläggande metodiken för OE-PCR, insektscellunderhåll och transfektion och fluorescensmikroskopi för den cellulära lokaliseringen av målproteiner.
Heterologa proteinexpressionssystem är viktiga verktyg för produktion av rekombinanta proteiner som används i talrika nedströms tillämpningar 4. Att välja från de olika uttryckssystem tillgängliga beror på slutmålet för proteinet av intresse. Flera insektscellexpressionssystem finns tillgängliga som erbjuder flexibla alternativ till prokaryota och eukaryota celler expressionssystem 5, 6. Insekts system som kräver bakulovirusi…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Lynn Forlow-Jech och Dannialle LeRoy för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av bas CRIS finansiering USDA ARS, nationella programmet 304 – Crop Protection och karantän [Project # 2020-22620-022-00D] till JAF och JJH Omnämnandet av firmanamn eller kommersiella produkter i denna artikel är endast i syfte att ge specifik information och innebär inte någon rekommendation från US Department of Agriculture. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.
KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |