In questo protocollo, gabbia della proteina chinasi A (PKA), un bioeffector di trasduzione del segnale cellulare, era immobilizzata su una superficie di nanoparticelle, microiniettata nel cytosol e attivata da upconverted UV luce da irradiazione di vicino infrarosso (NIR), che inducono disintegrazione di fibra a valle dello stress nel citosol.
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Articolo metodologico
Un sistema integrato di attivare remotamente la trasduzione del segnale intracellulare di fotoattivazione Upconversion Nanoparticle-mediata della chinasi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Upconversion delle nanoparticelle (UCNP)-mediata fotoattivazione è un nuovo approccio in remoto il controllo bioeffectors con molto meno fototossicità e con più profonda penetrazione del tessuto. Tuttavia, la strumentazione esistente sul mercato non è facilmente compatibile con upconversion applicazione. Pertanto, modificando lo strumento disponibile in commercio è essenziale per questa ricerca. In questa carta, illustriamo prima le modifiche di un fluorimetro convenzionale e microscopio a fluorescenza per renderli compatibili per gli esperimenti di upconversion di fotone. Descriviamo quindi la sintesi di un vicino-infrarosso (NIR)-attivato in gabbia proteina chinasi A sola subunità catalitica (PKA) immobilizzati su un complesso UCNP. Parametri per microiniezione e NIR fotoattivazione procedure inoltre sono segnalati. Dopo il PKA-UCNP in gabbia è microiniettati in cellule del fibroblasto REF52, l'irradiazione di NIR, che è significativamente superiore all'irradiazione UV convenzionale, attiva in modo efficiente la via di trasduzione del segnale PKA in cellule viventi. Inoltre, esperimenti di controllo positivi e negativi confermano che la via di PKA-indotta che conduce alla disintegrazione delle fibre di stress specificamente è innescata da irradiazione di NIR. Così, l'uso di UCNP proteina-modificato fornisce un approccio innovativo per il controllo remoto esperimenti cellulari luce modulata, in cui l'esposizione diretta ai raggi UV deve essere evitato.
Introduzione
Proteine chimicamente modificati che possono essere fotoattivazione (ad es., proteine PKA in gabbia) sono state sviluppate come campo emergente in biologia chimica non invadente manipolare i processi biochimici intercellulari1,2 ,3. Utilizzando la luce come uno stimolo fornisce un'eccellente risoluzione spazio-temporale durante l'attivazione di questi ingabbiati proteine. Tuttavia, la luce UV può causare indesiderati cambiamenti morfologici, apoptosi e danno del DNA in cellule4,5. Quindi, recenti sviluppi ne....
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Protocollo
Nota: il protocollo descrive una modifica di strumentazione dettagliata per fotoattivazione assistita upconversion, una procedura sintetica per generare in gabbia PKA-UCNP, microscopia elettronica di trasmissione (TEM) della UCNP rivestite con silice e in gabbia PKA-UCNP esempi, installazione di fotolisi UV e NIR, preparazione delle cellule, microiniezione di PKA-UCNP, uno studio di fotoattivazione e la colorazione della fibra lo stress delle cellule di REF52.
1. Setup fluorimetro per Upconversion spettro misura
- installare un 4 X obiettivo obiettivo accanto al titolare del cuvetta dello spettrometro di fluorescenza in modo che i....
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Risultati
Il design del costrutto in gabbia enzima-UCNP è illustrato nella Figura 1. L'enzima PKA in primo luogo è stato reagito con il bromuro di 2-nitrobenzyl per generare un'inattiva della PKA in gabbia, e si era quindi elettrostaticamente immobilizzato sulla superficie del UCNP. UCNPs emettono la luce di upconverted e di conseguenza photolytically fendere i gruppi o-nitrobenzyl su 199 Cys e Cys 343, generando la PKA attivata. Immagini TEM e analisi di Bradford ha c.......
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Discussione
In precedenza, Hofmann e colleghe trovano che drammatici cambiamenti morfologici sono stati osservati in cellule REF52 dopo la microiniezione del libero PKA19. In un altro studio, il gruppo di Lawrence ha dimostrato che la PKA in gabbia può essere attivata in vivo, portando a cambiamenti morfologici e la disintegrazione delle fibre di stress quando sottoposti a fotolisi UV20. Precedenti rapporti sullo sfruttamento upconverted UV luce per fotoattivazione ha mostrato.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Nano scienze e tecnologia programma di Academia Sinica e il Ministero della scienza e tecnologia di Taiwan per il finanziamento (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| Tris(idrossimetil)amminometano | Sigma | 154563 | |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Cloruro di sodio | Sigma | 31434 | |
| Cloruro di potassio | Sigma | 12636 | |
| Acetato di ittrio idrato | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Tulium(III) acetato idrato | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O Acetato |
| itterbio(III) tetraidrato | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Acido oleico | Sigma | 364525 | |
| Metanolo | macron | 304168 | |
| Idrossido di sodio | Sigma | 30620 | |
| Fluoruro di ammonio | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cicloesano | J.T.Baker | 920601 | |
| Idrossido di ammonio (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammoniaca |
| Ortosilicato tetraetile (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Ditiotreitolo (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-idrossimaleimmide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA reagente bloccante l'attività |
| Soluzione stabilizzante proteica Prionex da collagene di maiale | Sigma | 81662 | Soluzione stabilizzante proteica |
| 2-nitrobenzil bromuro (NBB) | Sigma | 107794 | PKA reagente per gabbia |
| 8-(4-clorofeniltio)adenosina 3′,5′-monofosfato ciclico sale sodico | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| piruvato chinasi/deidrogenasi lattica enzimi dal muscolo di coniglio | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosina 5'-trifosfato disodico | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH ridotto da dipotassio | Sigma | N4505 | |
| Fosfoenolpiruvato | Sigma | P7127 | |
| PEP Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagente |
| proteina chinasi cAMP-dipendente | Promega | V5161 | Controllo dell'attività PKA |
| pET15b-PKACAT plasmide | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmide | CoralHue | AM-V0012 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, glucosio alto, piruvato | Gibco | 12800-017 | Cell terreno di coltura |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Terreno di coltura cellulare |
| Fetale Siero bovino fetale | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldeide | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Colorante per colorazione del nucleo |
| Alexa 594-falloidina | Invitrogen | A12381 | Colorante per colorazione F-actina |
| 5(6)-Carbossitetrametilrodammina | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine Pierce Coomassie (Bradford) | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubi/Valore nominale del filtro MWCO 12.000 - 14.000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Membrana per dialisi |
| Millex-HV Unità filtro per siringa, 0,45 &; micro; m, PVDF, 13 mm, sterilizzato a raggi gamma | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Microscopio elettronico a trasmissione | JEOL | JEM-1400 | |
| Spettrofotometro a fluorescenza | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| Spettrofotometro UV-Vis | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm filtro passa-lungo | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm specchio dicroico passa-corto | Chroma | NC265609 | |
| RT3 sistema CCD a colori | SPOT | RT2520 | |
| Illuminazione a fluorescenza | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Laser a diodi infrarossi | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Sorgente luminosa | spot UVATA UVATA-UPS412 | Con un LED UPH-056-365 nm a 200 mW/cm2 | |
| Sensore termico a pila | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Sistemi di dispensazione per microiniezione intracellulare |
| PC-10 Estrattore per aghi | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETRO Manometro digitale | Lutron | PM-9100 | |
| Monoasse Centrifuga oleodinamica | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17, refrigerata | Thermo Scientific | 75002421 |
Riferimenti
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged"....
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Ristampe e permessi
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