Endotelio vascolare controlla strettamente reclutamento leucocitario. Diapedesi inadeguata contribuiscono a malattie infiammatorie umane. Di conseguenza, alla ricerca di nuovi elementi regolatori dell'attivazione endoteliale è necessaria ideare terapie migliori per disordini infiammatori. Qui, descriviamo una metodologia globale per caratterizzare nuovi regolatori endoteliale che possono modificare del leucocita traffico durante l'infiammazione.
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Articolo metodologico
Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo strato endoteliale è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi nel corpo controllando molte funzioni diverse. Regolamento della risposta infiammatoria dallo strato endoteliale è fondamentale per combattere efficientemente ingressi è nocivi e aiuto nel recupero di aree danneggiate. Quando le cellule endoteliali sono esposti a un ambiente infiammatorio, ad esempio il componente esterno della membrana di batteri gram-negativi, lipopolisaccaride (LPS), esprimono solubile citochine pro-infiammatorie, quali Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e innescare il attivazione dei leucociti circolanti. Inoltre, l'espressione di molecole di adesione sulla superficie endoteliale E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 consente l'interazione e l'adesione dei leucociti attivati per lo strato endoteliale e alla fine lo stravaso verso il tessuto infiammato. In questo scenario, la funzione endoteliale debba essere strettamente regolata perché attivazione eccessiva o difettosa nel reclutamento dei leucociti potrebbe portare a patologie infiammatorie. Poiché molti di questi disordini non hanno un trattamento efficace, è necessario studiare nuove strategie con un focus sullo strato vascolare. Vi proponiamo le analisi complete che sono utili per la ricerca di nuovi regolatori endoteliale che modificano la funzione del leucocita. Analizziamo l'attivazione endoteliale tramite le destinazioni di espressione specifici coinvolti nel reclutamento leucocitario (ad esempio, citochine, chemochine e molecole di adesione) con diverse tecniche, tra cui: (reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale RT-qPCR), western-blot, saggi di adesione e citometria di flusso. Questi approcci determinano la funzione endoteliale in contesto infiammatorio e sono molto utili per eseguire analisi di selezione per caratterizzare nuovi regolatori infiammatori endoteliale che sono potenzialmente utili per la progettazione di nuove strategie terapeutiche.
Introduzione
L'infiammazione è una risposta biologica benefica contro agenti infettivi, con lo scopo principale di eliminare il patogeno e riparare il tessuto danneggiato. In determinate condizioni, come le infezioni croniche o malattie autoimmuni, l'infiammazione non si risolve. Invece, c'è una reazione anomala con continua infiltrazione dei leucociti, conseguente a una risposta immunitaria prolungata che porta al danno tissutale, fibrosi, perdita della funzione e nel complesso, disabilità e in alcuni morte casi del paziente. Questi disordini umani, catalogati come malattie infiammatorie, tutti coinvolgono i vasi sanguigni per il controllo di stravaso del leucocita
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Protocollo
1. coltura di cellule endoteliali
- di coltura del tessuto trattato piastre
- piastre di coltura del tessuto cappotto 100 mm con gelatina di 2,5 mL soluzione (in autoclave, gelatina di 0,1% in acqua distillata) per 30 min a 37 ° C; questo possono essere estrapolati al formato richiesto ben. Aspirare la soluzione di gelatina e lasciare piatti asciugare all'aria nella cappa di coltura del tessuto.
- Condizioni di coltura del tessuto
- coltivare le cellule MLEC-04 all'interno di un incubatore biologico (37 ° C, umidità 95%, 5% CO 2). Crescere le cellule in multimediale completo di Dulbec....
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Risultati
Valutazione dell'attivazione delle cellule endoteliali indotta da LPS da RT-qPCR
Le cellule di MLEC-04 siero morto di fame sono state stimolate da 100 ng/mL di LPS per 6 h, e l'espressione genica endoteliale è stata valutata mediante RT-qPCR confrontando l'espressione di marcatori di attivazione alla condizione di riposo. Come mostrato in Figura 1A, le cellule incubate LPS MLEC-04 ha indotto l'espressi.......
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Discussione
Questo protocollo endothelial descrive una tecnologia graduale che costituisce le basi per esplorare nuovi meccanismi coinvolti nella regolazione della risposta infiammatoria. Questi approcci sono basati sullo studio dell'attività endoteliale stimolata da LPS e valutare i passaggi critici coinvolti nel reclutamento dei leucociti durante la risposta infiammatoria, in particolare: liberazione di citochine endoteliale, adesione endoteliale adesione di molecole del leucocita e l'espressione a livello vascolare. Una volta sta.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) e l'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (concessione numero IERPY 1149/16 da A.L.; MPY 1410/09 a S. Hortelano); da MINECO attraverso il Fondo de Investigación en Salud (FIS) (assegna numeri PI11.0036 e PI14.0055 a S. Hortelano). S. Herranz è stata sostenuta da IERPY 1149/16 da ISCIII.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gelatina | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetale Siero Bovino Sigma | A4503 | ||
| Penicillina streptomicina | Lonza | DE17-602E | |
| Tripsina | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | Tampone di estrazione dell'RNA |
| Isopropanolo | Sigma | 33539 | |
| Etanolo absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Puro H2O | Qiagen | 1017979 | RNAsi libero |
| Agarosio | Pronadisa | 8020 | |
| Colorazione per gel di agarosio | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagenti per RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Colorazione fluorescente per qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | Piastre 4346906 | per qPCR |
| U-bottom 96 pozzetti | Falcon | 353072 | |
| Provette per citometria | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Tensioattivo non ionico |
| Tris-HCl | Panreac | 1.319.401.211 | |
| Cloruro di sodio | Merck | 1.064.041.000 | |
| Pirofosfato di sodio | Sigma | 221368 | |
| Fluoruro di sodio | Sigma | S7920 | |
| Ortovanadato di sodio | sigma | 13721-39-6 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | sigma | P8340 | |
| Kit di analisi delle proteine BCA | Pierce | 23225 | Reagenti per il dosaggio dell'acido bicinchoninico |
| β-mercaptoetanolo | merck | 805.740 | |
| Membrana di trasferimento PVDF, 0,45 &; m | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polisorbato 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL Millipore | WBKLS0500 | ||
| Fibronectina | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagene tipo I | Sigma | c8919 | |
| Acido acetico | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Blu di tripano | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldeide | Sigma | P6148 | |
| Metanolo | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Cristallovioletto | Sigma | HT90132 | |
| Citrato di sodio | Sigma | C7254 | |
| Etanolo 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Lettore di micropiastre multimodale |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Sistema di documentazione |
| Gel StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus sistema qPCR | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Apparecchiature per citometria |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Sistema di rilevamento della chemiluminescenza |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Utilizzare a 10 &; micro; g/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Uso a 10 & micro; g/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Utilizzare a 10 &; micro; g/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Uso a 10 µ g/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Utilizzare a 10 &; micro; g/mL |
| anti-ratto IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Uso a 10 &; micro; g/mL |
| criceto anti-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Uso a 10 &; micro; g/mL |
| Controllo dell'isotipia IgG di ratto | Invitrogen | 10700 | Utilizzare a 10 µ g/mL |
| Criceto armeno Controllo dell'isotipo IgG | Invitrogen | PA5-33220 | Utilizzare a 10 &; micro; g/mL |
| P-Iκ β-α | Segnalazione cellulare | 2859 | Utilizzo a 10 & micro; g/mL |
| β-Actina | Sigma | A5441 | Utilizzare a 10 µ g/mL |
| Segnalazione cellulare | P-ERK | 9101 | Utilizzo a 10 &; micro; g/mL |
| anti-topo HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Uso a 1:10.000 |
| anti-coniglio HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Uso a 1:10.000 |
| anti-ratto HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Uso a 1:10.000 |
Riferimenti
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K.
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Ristampe e permessi
