Оптимизированный Hemagglutination Assay ингибирование (HI) поддается гриппа специфические антитела титры
Summary
Представлены протоколы описывают, как выполнять пробирного торможение гемагглютинации поддается титры гриппа специфические антитела от образцов сыворотки получателей вакцины против гриппа. Первая проба определяет оптимальный вирусного антигена концентрации гемагглютинации. Вторая проба дает количественную оценку гриппа специфические антитела титры на торможение гемагглютинации.
Abstract
Титры антител часто используются в качестве суррогатных маркеров для серологических защиты против гриппа и других патогенов. Для понимания вакцины индуцированной иммунитет требуется детальное знание продукции антитела до и после вакцинации. Эта статья описывает надежный протокол точка за точкой для определения гриппа специфические антитела титры. Первый протокол описывает метод для определения антигена сумм, требуемых для гемагглютинации, которая стандартизирует концентрации для последующего использования во втором протоколе (hemagglutination assay, пробирного HA). Второй протокол описывает количественная оценка титры гриппа специфические антитела против различных вирусных штаммов, используя последовательный разбавление человеческой сыворотки или клетки культуры supernatants (пробирного торможение гемагглютинации, Привет пробирного).
В качестве примера прикладной мы показываем реакции антитела здорового когорты, который получил трехвалентного инактивированной противогриппозной вакцины. Кроме того показано перекрестной реактивности между различными гриппа и описаны методы для сведения к минимуму перекрестной реактивности с использованием различных типов животных красных кровяных телец (эритроцитов). Обсуждение освещает преимущества и недостатки представленных анализов и как определение титры гриппа специфические антитела могут улучшить понимание связанных с вакциной иммунитета.
Introduction
Заражение вирусом гриппа связано с значительным заболеваемости, смертности и высокие расходы на здравоохранение в1,2,3,4. В частности пожилых людей, новорожденных, беременных женщин и пациентов с хронической болезнью подвергаются риску для более серьезных клинических исходов. Таким образом вакцинация против циркулирующих штаммов вируса гриппа является основной мерой для уменьшения бремени болезней в этих групп риска. Увеличение индивидуальной иммунной реакции после вакцинации, например, грипп специфические антитела выше защитная порога, уменьшает индивидуальный риск заражения и в общем вероятность передачи вируса среди населения 5. глубокое понимание вакцины индуцированной гуморального иммунного ответа в различных популяциях и через различных возрастных групп является ключевым элементом для ответа важные клинические вопросы6,,78 , 9, такие как: почему у некоторых пожилых пациентов инфекции несмотря на предыдущей вакцинации? Что такое «хорошо» и «достаточной» вакцина индуцированной защита? Как часто следует применять к ослабленным пациенту достичь защитные титры вакцины? Что является наиболее эффективным дозировка? Что такое влияние новых адъювантов на титры антител после вакцинации? Измерение вакцины специфических антител может помочь ответить на эти важные вопросы и улучшить результаты вакцинации.
Количественная оценка титры вирус специфических антител может выполняться с различными иммунологических методов. Это включает в себя твердофазный10 или на основе бисера assays ELISA11 , Привет пробирного12и нейтрализации анализов13. Методы, основанные на ИФА позволяют скрининг относительно большое количество образцов сыворотки против различных антигенов. Кроме того можно отдельно изучить возбудителя-иммуноглобулина М (Ig) и IgG. Хотя характеристики антиген, например, линейные аминокислотной последовательности или вирусоподобных частиц может повлиять связывание антител, спектр потенциальных epitopes очень широк и не предоставляют информацию о ли антитела Ответ имеет функциональное значение.
В противоположность этому нейтрализация assay определяет потенциал антител функционально подавлять заражения клеток и таким образом отражает нейтрализации потенциальных. Однако этот метод является очень трудоемким, требует культивирование специфических клеток линии и жить вирусы, и поэтому она является длительным, дорогостоящим и требует специального оборудования.
Эта статья описывает шаг за шагом на основе Всемирной организации здравоохранения ВОЗ Привет протокол12 к количественно гриппа специфические антитела титры. Hemagglutination является характерным эффект некоторых вирусов, ведущих к Агглютинация эритроцитов. Ингибирование этот эффект с пациентами сыворотки позволяет измерения концентрации ингибирующее антитела, который отражает нейтрализующего эффекта.
Мы изменили процесс ВОЗ-протокола позволяет более эффективной обработки нескольких образцов в то же время и тем самым уменьшая необходимое время. Первый протокол описывает определение агглютинации потенциал конкретного гриппа антигена. Поступая таким образом, для второго протокола определяется концентрация антигена правильный гриппа. Эта часть должна быть повторена с каждой новой вирусного антигена, так как каждая партия крови.
Второй протокол описывает определение гриппа специфические антитела титры. Представлены протоколы оптимизированы для расследования вируса гриппа и образцы сыворотки крови человека, однако, он также может применяться для образцов сыворотки мыши или supernatants культуры клеток от стимулированных иммунокомпетентных клеток, например, вирус специфических B-клетки. Результаты могут быть определены как абсолютных измерений титры. Во многих исследованиях вакцины геометрическое титры и 95% доверительный интервал отображаются для каждого конкретного населения. Для интерпретации, серопротекции или сероконверсия часто используются для описания восприимчивость населения к определенным вирусом. Серопротекции определяется как титр ≥1:40 и сероконверсии, ростом более чем 4 раза титр с достижением титры seroprotective между двумя моментами времени (наиболее часто используются предварительно вакцинации и 30 дней после вакцинации).
Оба протокола, просты в использовании, и они могут быть адаптированы к широкому спектру вопросов исследования. В частности, они могут использоваться для определения надежно и быстро титры антител против различных других вирусов с емкостью для гемагглютинации, например, краснухи, эпидемического паротита, кори и polyomaviruses14,15,16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественная оценка до и после вакцинации против гриппа вирус специфическое антитело титры является важным инструментом необходимых для исследования вакцины. На основании суррогатного меры защиты против вирусной инфекции, такие как серопротекции (> 1:40) или сероконверсия (титр 4-кра?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
нет.
Materials
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
References
- . Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices–United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, 1-43 (2013).
- Dominguez-Cherit, G., et al. Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico. JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).
- Fox, B. D., et al. Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates. J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).
- Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. f. G. S. V., Values, M. . The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , (2003).
- Barclay, V. C., et al. Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity. PLoS One. 9 (2), 87042 (2014).
- Baluch, A., et al. Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients. Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).
- Haralambieva, I. H., et al. The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects. PLoS One. 10 (3), 0122282 (2015).
- Egli, A., et al. Vaccine adjuvants–understanding molecular mechanisms to improve vaccines. Swiss Med Wkly. 144, 13940 (2014).
- O’Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. Changing face of vaccination in immunocompromised hosts. Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420 (2014).
- Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens. Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).
- Martins, T. B. Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).
- Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).
- Mittelholzer, C. M., et al. Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies. Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).
- Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus. J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).
- Kumakura, S., et al. Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel. J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).
- Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria. J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).
- Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay. Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).
- Lee, P. S., et al. Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus. Nat Commun. 5, 3614 (2014).
- Blumel, B., et al. Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010. Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).
- Reber, A. J., et al. Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains. J Infect Dis. , (2016).
