En optimerad Hemagglutination hämning (HI) analys att kvantifiera influensa-specifik antikropp titrar
Summary
De presenterade protokoll beskrivs hur du utför en hemagglutination hämning analys för att kvantifiera influensa-specifik antikropp titrar från serumprover av influensa vaccin mottagare. Första analysen avgör optimal virusantigen koncentrationer av hemagglutination. Den andra analysen kvantifierar influensa-specifik antikropp titrar av hemagglutination hämning.
Abstract
Antikroppsnivåerna var används ofta som surrogatmarkörer för serologiska skydd mot influensa och andra patogener. Detaljerad kunskap om produktion av antikroppar före och efter vaccination krävs att förstå vaccin-inducerad immunitet. Denna artikel beskriver en pålitlig punkt-för-punkt-protokoll för att avgöra influensa-specifik antikropp titrar. Det första protokollet beskriver en metod för att ange de antigen belopp som krävs för hemagglutination, som standardiserar halterna för senare användning i det andra protokollet (hemagglutination assay, HA assay). Det andra protokollet beskriver kvantifiering av influensa-specifik antikropp titrar mot olika virusstammar med hjälp av en seriell utspädning av humant serum eller cell cellkulturer (hemagglutination hämning analys, HI assay).
Tillämpas exempelvis visar vi antikroppssvaret av en hälsosam kohort, som mottog en trivalent inaktiverat influensavaccin. Dessutom visas korsreaktivitet mellan de olika influensavirus och metoder för att minimera korsreaktivitet med olika typer av djurs röda blodkroppar (RBC) förklaras. Diskussionen belyser fördelar och nackdelar med de presenteras analyserna och hur fastställandet av influensa-specifik antikropp titrar kan förbättra förståelsen av vaccinrelaterade immunitet.
Introduction
Infektion med influensavirus är förknippat med betydande morbiditet, mortalitet och höga sjukvårdskostnader1,2,3,4. Särskilt löper äldre, nyfödda, gravida och patienter med kroniska sjukdomar risk för svårare kliniska resultat. Vaccination mot cirkulerande influensa virusstammar är därför den primära åtgärden för att minska sjukdomsbördan i dessa högriskgrupper. Ökningen av enskilda immunsvaret efter vaccination, t.ex., influensa-specifika antikroppar ovan en skyddande tröskel, minskar den individuella risken av infektion och i allmänhet sannolikheten för virusöverföring inom en befolkning 5. en detaljerad förståelse av det vaccin-inducerad humorala immunsvaret i olika populationer och i olika åldersgrupper är en nyckelfaktor att besvara viktiga kliniska frågor6,7,8 , 9, såsom: Varför har vissa äldre patienter infektioner trots tidigare vaccination? Vad är en ”bra” och ”tillräcklig” vaccin-inducerad skydd? Hur ofta ska ett vaccin tillämpas en immunsupprimerade patienten att nå skyddande titrar? Vad är den mest effektiva dosen? Vad är effekten av en roman adjuvant på efter vaccination antikroppsnivåerna var? Mätning av vaccinet-specifik antikroppsproduktion kan hjälpa svara på dessa viktiga frågor och förbättra vaccination utfall.
Kvantifiering av virus-specifika antikropp titrar kan utföras med olika immunologiska metoder. Detta inkluderar fasta fasen10 eller pärla-baserade ELISA11 -analyser, HI assay12och neutraliserande analyser13. ELISA-baserade metoder kan screening av relativt stora mängder serumprover mot olika antigener. Också, patogen-immunglobulin (Ig) M och IgG kan separat utforskas. Även om egenskaperna hos ett antigen, t exden linjära aminosyrasekvens eller virusliknande partiklar kan påverka bindningen av antikroppar, spektrumet av potentiella epitoper är mycket bred och ger ingen information om huruvida en antikropp svar har funktionell betydelse.
Däremot de neutralization assay bestämmer potentialen av antikroppar funktionellt hämma infektionen av celler och därför speglar neutralizationen potentiella. Men denna metod är mycket arbetsintensivt, kräver odling av cellinjer och levande virus, och därför, det är tidskrävande, dyra, och kräver särskild utrustning.
Denna artikel beskriver en stegvisa Världshälsoorganisationen WHO-baserade HI protokoll12 för att kvantifiera influensa-specifik antikropp titrar. Hemagglutination är en karakteristisk effekt av vissa virus som leder till agglutinationen av erytrocyter. Hämning av denna effekt med patientsera tillåter mätning av hämmande antikroppar, vilket återspeglar en neutraliserande effekt.
Vi har ändrat arbetsflödet av WHO-protokollet att tillåta en mer effektiv hantering av flera prover samtidigt och därmed minska tid som krävs. Det första protokollet beskriver bestämningen av ett särskilt influensa antigen agglutination potential. Så bestäms den rätta influensa antigen koncentrationen för det andra protokollet. Denna del bör upprepas med varje ny virusantigen, liksom varje batch av blod.
Det andra protokollet beskriver bestämningen av influensa-specifik antikropp titrar. De presenterade protokoll är optimerade för utredning av influensavirus och humant serumprover men, det kan också tillämpas för mus serumprover eller cell-cellkulturer från stimuleras immuna celler, t.ex., virus-specifika B-celler. Resultaten kan bestämmas som absolut uppmätta titrar. I många vaccin studier visas de geometriska titrarna och 95% konfidensintervallet för varje särskild population. För tolkning, seroprotektion eller serokonversion är ofta används för att beskriva känsligheten för en befolkning till vissa virus. Seroprotektion definieras som en titer ≥1: 40 och serokonversion som en mer än 4-faldig titer öka med prestation av seroprotektion antikroppnivåer mellan två tidpunkter (de flesta vanligen används före vaccination och 30 dagar efter vaccination).
Båda protokollen är lätt att använda och de kan anpassas till ett brett spektrum av frågeställningar. I synnerhet, de kan användas för att fastställa tillförlitligt och snabbt de antikropp titrarna mot olika andra virus med kapacitet för hemagglutination, såsom mässling, polyomaviruses, påssjuka eller röda hund14,15,16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantifiering av före och efter vaccination influensa virus specifik antikropp titrar är ett viktigt verktyg som är nödvändiga för vaccinet studier. Baserat på åtgärderna som surrogat för skydd mot virusinfektion, såsom seroprotektion (> 1:40) eller serokonversion (4-faldig titer ökning), vaccination strategier kan vara optimerade9. Med hjälp av de medföljande protokoll kan bestämma: a hemagglutination potential ett virus, och (ii) antikropp titrar för ett virus av intresse.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ingen.
Materials
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
References
- . Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices–United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, 1-43 (2013).
- Dominguez-Cherit, G., et al. Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico. JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).
- Fox, B. D., et al. Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates. J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).
- Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. f. G. S. V., Values, M. . The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , (2003).
- Barclay, V. C., et al. Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity. PLoS One. 9 (2), 87042 (2014).
- Baluch, A., et al. Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients. Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).
- Haralambieva, I. H., et al. The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects. PLoS One. 10 (3), 0122282 (2015).
- Egli, A., et al. Vaccine adjuvants–understanding molecular mechanisms to improve vaccines. Swiss Med Wkly. 144, 13940 (2014).
- O’Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. Changing face of vaccination in immunocompromised hosts. Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420 (2014).
- Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens. Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).
- Martins, T. B. Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).
- Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).
- Mittelholzer, C. M., et al. Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies. Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).
- Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus. J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).
- Kumakura, S., et al. Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel. J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).
- Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria. J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).
- Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay. Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).
- Lee, P. S., et al. Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus. Nat Commun. 5, 3614 (2014).
- Blumel, B., et al. Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010. Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).
- Reber, A. J., et al. Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains. J Infect Dis. , (2016).
