طريقة عزل رواية الصف سريرية للكلى البشرية ارتشاح الخلايا اللحمية

Summary

نقدم هنا طريقة العزلة والثقافة رواية الصف سريرية للكلى “ارتشاح الخلايا اللحمية” (كبسكس) استناداً إلى نضح الجهاز كله مع إنزيمات الجهاز الهضمي، وتخصيب اليورانيوم في NG2-الخلية. بهذه الطريقة، من الممكن الحصول على إعداد كافية من الخلايا للعلاج.

Abstract

الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) هي التماثل الساكن ومحصنة ضد مودولاتوري خلايا الأنسجة التي أظهرت آثار مفيدة في أمراض الكلي وزرع الأعضاء. مشاركة “ارتشاح الخلايا اللحمية” (PSCs) الخصائص مع نخاع العظام MSCs (bmMSCs). ومع ذلك، أيضا لديهم، على الأرجح نظراً لطابعة محلية، والخصائص الخاصة بالانسجة وتلعب دوراً في التوازن الأنسجة المحلية. قد يؤدي هذا التحديد الأنسجة في إصلاح الأنسجة محددة، وأيضا داخل الكلي البشرية. أظهرنا سابقا أن PSCs الكلي البشرية (كبسكس) قد عززت الكلي الظهارية الجرح الشفاء حين بمسكس لم تكن هذه الإمكانية. وعلاوة على ذلك، يمكن تحسين كبسكس إصابة الكلي في الجسم الحي. ولذلك، كبسكس تشكل مصدرا لاهتمام للعلاج بالخلايا، خاصة بالنسبة لأمراض الكلي وزراعة الكلي. هنا نعرض تفصيلاً طريقة العزلة والثقافة كبسكس من الصف زرع الكلي البشرية استناداً إلى نضح الجهاز الجامع للإنزيمات الهضمية عبر الشريان الكلوي وإثراء لعلامة ارتشاح في NG2. وبهذه الطريقة، يمكن الحصول كميات كبيرة الخلية التي تصلح للعلاج.

Introduction

الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) هي الخلايا المناعية مودولاتوري التي كانت أصلاً المعزولة من نخاع العظام. أنها تتميز المغزل بها تتشكل مورفولوجيا، القدرة على التفريق في الدهون والعظام والغضاريف والتقيد البلاستيك. أعرب MSCs عن علامات stromal CD73، CD90، CD105 حين يجري سلبية بالنسبة لعلامات CD31 و CD45^1،،من²³. MSCs مرشح واعدة لخلية العلاج نظراً للتماثل الساكن الأنسجة وقدرات إيمونومودولاتوري. وتجري حاليا دراسة بمسكس في التجارب السريرية للعديد من الأمراض، بما في ذلك أمراض الكلي وزراعة الكلي كما استعرضت في أماكن أخرى⁴.

سابقا قد اتضح أن ارتشاح الخلايا من عدة أجهزة صلبة مختلفة، بما في ذلك الأنسجة الدهنية، والمشيمة، والهيكل العظمى والعضلات مشاركة الخصائص مع MSCs⁹. ومع ذلك، يحمل هذه الخلايا أيضا المهام الخاصة بالانسجة التي يمكن أن تسفر عن إصلاح أورجانوتيبيك¹⁰. على سبيل المثال، الخلايا البشرية ارتشاح احتشاء عضلة القلب، وتحفز استجابات الأوعية بعد نقص ومتباينة في cardiomyocytes، بينما ارتشاح الخلايا المعزولة من الأنسجة الأخرى لم تظهر هذه الإمكانات¹¹.

يمكن أيضا أن الخلايا اللحمية ارتشاح معزولة من الماوس^12،،من¹³¹⁴ والكلى البشرية^15،16. ونحن على نطاق واسع يتسم كبسكس ومقارنة هذه إلى بمسكس. وجدنا أن كبسكس، شبيه بمسكس، تتمتع بقدرات كآبته، ويمكن أن تدعم تشكيل ضفيرة الأوعية الدموية. ومع ذلك، هناك الأنسجة توجد بعض الاختلافات بين أنواع الخلايا، كما أظهر توقيع تعبير النسخي أورجانوتيبيك، بما في ذلك عوامل النسخ نيفروجينيك HoxD10 و HoxD11 كبسكس. لم تطرأ التحول أرومية بعد التحفيز مع TGF-β كبسكس، وعلى النقيض من بمسكس، ولم يتمكنوا من التفريق في adipocytes. وعلاوة على ذلك، تسارع كبسكس سلامة الظهارية في جرح الظهارية أنبوبي كلوي مقايسة الصفر، ظاهرة التي لم يلاحظ مع بمسكس. هذا الجرح تعزيز إصلاح تمت بوساطة من خلال الإفراج عن عامل النمو تتمثل. وعلاوة على ذلك، تحسنت كبسكس إصابة الكلي في طراز ماوس كلوي حاد إصابة¹⁵. ولذلك، يبدو أن لديها قدرات متفوقة الكلوي إصلاح كبسكس وهي مصدر جديدة مثيرة لاهتمام لعلاج الخلايا في أمراض الكلي.

ولكي تكون قادراً على استخدام كبسكس لأغراض العلاج الخليوي، ينبغي أن تكون معزولة كبسكس بطريقة الصف سريرية مع الإنزيمات السريرية الصف والبروتوكولات. وعلاوة على ذلك، أن تكون قادرة على علاج العديد من المرضى مع كبسكس من المانحين 1، إعداد كافية من الخلايا ينبغي الحصول على. هنا نعرض بالتفصيل، إجراءات عزل الصف السريرية كبسكس من الصف كله زرع الكلي، مما أسفر عن إعداد كافية من الخلايا التي سيتم استخدامها للعلاج السريري.

Protocol

The local medical ethical committee and ethical advisory board of the European consortium (STELLAR) approved the research and collection of human transplant grade kidneys discarded mainly for surgical reasons. Research consent was given for all kidneys. 1. Preparations for Cell Culture Prepare a pool of platelet lysates. Store the platelets that have expired for less than 2 d in -80 °C until use (for a maximum of 1 year). NOTE: The platelets were originally sourced from a commercial vendor. Hospital surplus material distributed by the local blood bank were obtained. Thaw the platelets of at least 5 donors (preferably 10) O/N at 4 °C. Pool the platelets in a large sterile bottle, transfer to conical centrifuge tubes and spin down for 10 min at 1,960 x g at 4 °C. NOTE: The volume of platelets depends on the number of donors and the amount of hospital surplus material per donor. Pipette the supernatant to blood bags (50 mL/bag) through the barrel of a 50 mL syringe. Store at -80 °C. Preparation of cell culture medium. Defrost one bag of platelet lysates in a water bath at 37 °C. Add 1 L (i.e. 2 bottles) of Minimum Essential Medium – alpha modification (alphaMEM), 5 mL 200 mM glutamine, and 20 mL of penicillin (5,000 U/mL)/streptomycin (5,000 µg/mL) (pen/strep) to the bag. Incubate for 3 h at 37 °C. Shake the bag for degelling by gently tapping on the bag when the bag is resting on a flat surface. Filter the 5% platelet lysates medium by pulling the lysates through the filter of the transfusion system with a sterile 50 mL syringe. Aliquot the medium in 50 mL tubes and store in -80 °C until use. NOTE: Every new batch of platelet lysates is tested in cell culture and compared to the previous batch by growing cells of interest (bmMSCs or kPSCs) to confluency in both batches. In cell numbers and viability, the kPSCs or bmMCs grown in the new batch should not differ more than 10%, and the marker expression of CD73, CD90, CD105 and CD31, CD34 and CD45 as analyzed by flow cytometry should not differ. The methods of cell culture are described in section 6 of the protocol (Culture of kPSC). 2. Preparations for Cell Harvest Preparation of solutions. Prepare the plain medium by adding 10 mL of pen/strep to 500 mL (1 bottle) of Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12. Prepare the washing medium by adding 50 mL of Normal Human Serum (NHS) and 10 mL of pen/strep to 1 bottle of DMEM-F12. Prepare the enzyme-stock buffer by adding 2.9 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.2 mL NaHCO3 2.5% [w/v] and 160 µL CaCl2 (1 M) to 160 mL University of Wisconsin solution. Prepare the collagenase solution by slowly adding 20 mL of enzyme stock buffer to the bottle of GMP-grade collagenase containing >2,000 U/bottle collagenase. Dissolve at 4 °C for approximately 40 min. Gently shake several times during the dissolving period. Prepare the freeze medium by adding 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) to 45 mL NHS. Preparation of perfusion tray (Figure 1A). Clean the flow cabin and cover with surgical drapes. Heat a water bath to approximately 40 – 45 °C to heat the perfusion tray to 37 °C. Put on surgical gowns and surgical gloves. Connect a sterilized perfusion tray to the water bath to preheat the perfusion tray with warm water. Make sure that there is no air in the perfusion tray by starting with the perfusion tray in the vertical position. If necessary add more water to the water bath to prevent air infusion into the perfusion tray. Place the LS25 tube in the pump. Leave both sterile ends of the tube in the flow cabinet. Place a Kocher's forceps on one end of the tube and allow to rest on the bottom of the perfusion tray. Place a sterile gauze on top of the tube to prevent obstruction. Attach a Luer connector on the other tube end. Add approximately 100 mL of plain medium into the perfusion tray and start flushing the tube on a pump speed of 100 mL/min. 3. Kidney Cell Isolation Preparation of the kidney. Remove the kidney from the double sterile bags and place on the sterile perfusion tray (Figure 1B). Remove the perirenal adipose tissue and kidney capsule with scissors and gentle tearing (Figure 1C) and identify the renal artery on the aortic patch as shown in Figure 1D. Cannulate the renal artery with the accessory spike, fix with a sterilized tie-rip, and attach to the pump tube end with the Luer connector while the pump is on. If the tubes are not completely filled, first add more medium to the tray and flush tubes by starting the pump (Figure 1E – F). Flush the kidney with plain medium via the pump with a flow of 100 mL/min. Collagenase treatment and kidney cell isolation. Add collagenase (20 mL, >2,000 U) and DNase (2.5 mL, 1 mg/mL) to the perfusion tray (Figure 1G). Turn the kidney from time to time gently by hand. Wait until the kidney becomes soft and the perfusion liquid becomes less transparent (approximately 30 – 40 min). Gently massage the kidney (Figure 1H) until a cell suspension is obtained (Figure 1I). Remove non-digested material and the spike in the renal artery. Washing and collection of kidney cells. Add 50 mL of the NHS to the cell suspension. Drain the cell suspension from the perfusion tray by putting the pump at low flow and placing the tube first connected to the kidney above the 50 mL tubes (Figure 1J). Centrifuge at 300 x g for 7 min at 4 ˚C and remove the supernatant. Wash the pellets with washing medium containing 10% NHS and again centrifuge at 300 x g for 7 min. Repeat washing once more. Measure the volume of the cell pellets and add an equal volume of cell culture medium. Either cryopreserve the cells from here by adding freezing medium 1:1 to the cell suspension and store in cryogenic vials according to standard protocols, or continue to culture the cells (section 4). NOTE: The cell suspension contains cell clumps and requires extra steps to obtain single cells, which results in an increase in cell death. Therefore, the cells are kept in suspension and are not counted at this stage. 4. Cell Culture of Crude Kidney Cells Add approximately 1 mL of the cell suspension to 24 mL of alphaMEM 5% platelet lysates (cell culture medium) in a T175 cell culture flask (Figure 1K) and culture at 37 °C, 5% CO2. Remove the medium and cell debris after 2 d from the adherent cells and refresh the medium with 25 mL of cell culture medium. Refresh the culture medium twice a week by removing half of the medium (12.5 mL) and adding fresh medium (12.5 mL) using aseptic techniques. Culture until confluent (usually 5 – 7 d) (Figure 1L). Remove the medium, wash twice with PBS and trypsinize the cells by adding 5 mL trypsin to each T175 flask for 5 min at 37 °C. Wash in culture medium and centrifuge at 490 x g for 5 min and remove the supernatant. 5. Cell Enrichment for NG2 by Magnetic Cell Separation (Figure 1M) Prepare the cell separation buffer according to manufacturer's protocol. Resuspend the trypsinized kPSCs in 10 mL cell separation buffer. Centrifuge at 490 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the cells in 300 µL cell separation buffer. Add 100 µL FcR blocking reagen/5 x 107 cells, add 100 µL anti-melanoma (NG2) beads per 5 x 107 cells, and incubate for 30 min at 4 °C. Separate the NG2-positive fraction according to manufacturer's protocol. Add 10 mL of medium and centrifuge cells for 5 min at 490 x g. Count the cells using a Bürker counting chamber according to manufacturer's protocol. Seed the cells in a culture flask (approximately 4 x 103 cells/cm2) and incubate. NOTE: Seed the cells in the following concentrations: <250,000 in a T25 flask, 250,000 – 500,000 in a T75 flask, and 700,000 – 800,000 in a T175 flask. After magnetic cell enrichment, a positive fraction of approximately 1 – 2% is isolated. However, as this step is cell enrichment and not cell sorting, other cell types will be present in the culture (Figure 1N). After several passages (usually around 4 – 5), only a homogenous kPSC-population is present (Figure 1P). 6. Culture of kPSCs Refresh the medium twice a week by removing half of the medium and replace it with freshly thawed culture medium (Figure 1N). NOTE: The kPSCs tend to be more viable and proliferative when only half of the medium is refreshed. Passaging of kPSCs. NOTE: Passage the kPSCs at either 90 – 100% confluency, or when 3D structures appear (see Figure 1O), or when there hasn't been cell growth for more than a week. The latter two particularly might occur at early passages after cell enrichment. In this case, after passaging, the cells will usually start to grow again in monolayer culture (Figure 1P). Remove the medium from the 90 – 100% confluent cells (keep the medium for later use). Wash the flask twice with PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Add trypsin (0.5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) and incubate for 5 min at 37 °C. Add the old medium to the flask and resuspend gently. Transfer to a 15 or 50 mL tube (depending on the volume) and centrifuge at 490 x g for 5 min. Count the viable cells and plate <250,000 in a T25, 250,000 – 500,000 in a T75, or 700,000 – 800,000 in a T175 (approximately 4 x 103 cells/cm2). Test the kPSCs at passage 5 or 6 (e.g., scratch assay, section 7). NOTE: Characterize the propagated cells by flow cytometry using standard protocols. Marker expression of NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC should all be positive and CD31, CD34, CD45 and HLA-DR should be negative. Test for mycoplasma, bacteria and fungi in the culture medium according to standard protocols of the clinical microbiology lab. Test the kPSCs functionally in a kidney epithelial wound scratch assay. Experiments are usually performed with sterile, flow cytometry-confirmed homogeneous kPSC populations with wound healing capacity between passage 6-8. Cryopreserve the kPSCs by adding 0.5 mL cryopreservation medium to 0.5 mL cell suspension (2 million cells per mL of culture medium) using standard protocols. NOTE: After thawing, seed the kPSCs at a higher density (106 cells in a T175). 7. Functional Test of kPSCs: Kidney Epithelial Wound Scratch Assay Culture the kPSCs in a 6-well plate at a density of 200,000 cells/well in 2 mL culture medium. After 48 h of culture at 37 °C, 5% CO2, collect the supernatant. This is the conditioned medium. Seed the HK-2 (proximal tubular epithelial cells)17 in 2 mL of Proximal Tubular Epithelial Cell (PTEC) medium consisting of a 1:1 ratio of DMEM-F12 supplemented with insulin (5 mg/mL), transferrin (5 mg/mL), selenium (5 ng/mL), hydrocortisone (36 ng/mL), triiodothyrinine (40 pg/mL), epidermal growth factor (10 ng/mL) and pen/strep, in a density of 500,000 cells per well in a 6-well cell culture plate. Culture for 48 h at 37 °C, 5% CO2. Remove the cell culture medium of the HK-2s and create a scratch wound in the monolayer of HK-2s by making a scratch with the tip of a yellow pipette point from the top to the bottom of the well. Wash the HK-2s with PBS and add the conditioned medium of the kPSCs or control medium. Mark on the bottom of the plate the area to be imaged. NOTE: The HK-2s should be confluent. Image two areas per well. Image the scratch at 4, 8, 12 and 24 h at the same marked position with an inverted bright-field microscope. Measure the scratch area in Image J using the polygon selection tool to determine the percentage of closure.

Representative Results

ويرد في الشكل 1طريقة العزل كبسكس الصف السريرية. خلايا الكلي الخام معزولة عن زرع الأعضاء البشرية الصف الكليتين نضح كولاجيناز. هو مثقف تعليق الخلية الناتجة حتى روافد في ليساتيس الصفائح الدموية 5%. ثم الكسر الخلية اللحمية ارتشاح يتم عزل استناداً إلى التعبير في NG2. كبسكس بلاستيكية ملتصقة على شكل المغزل الخلايا (الشكل 2ألف) وهي إيجابية لعلامات علامات stromal CD73، CD90، CD105، وارتشاح NG2، بدجفر-ب و CD146، بينما السلبية ل CD31، CD34، CD45 وهلا-الدكتور (الشكل 2ب). عادة، يمكن التوصل إلى عدد سكان متجانسة من كبسكس في ممر 4 وتصل كبسكس إلى الشيخوخة حول مرور 9-10 (الشكل 2-ج). ولذلك فإننا ننصح بالقيام بتجارب بين سن 5-8. لتقييم القدرة الوظيفية كبسكس معزولة، نحن إجراء في المختبر الكلي الظهارية الجرح الصفر مقايسة على كل دفعة جديدة من كبسكس، كما أظهرنا سابقا أن المتوسط مكيفة من كبسكس يمكن أن يسرع في التئام الظهارية في هذا التحليل الصفر15. المتوسط كبسك مكيفة باستزراع كبسكس عن 48 ساعة في الفاميم 5% ليساتيس الصفائح الدموية وجمع المادة طافية. المقبل، هي استزراع الخلايا الظهارية (هونج كونج-2) أنبوب الدانية مخلدة الكلي البشرية17 حتى روافد وثم يتم إجراء جرح الصفر. ثم أما المتوسطة مكيفة من متوسطة كبسكس أو عنصر تحكم إضافة إلى الآبار وتقاس سرعة التئام الجروح. عندما تتم إضافة وسيلة مكيفة كبسكس، يغلق الجرح أسرع بشكل ملحوظ (الشكل 2د). الشكل 1 : كبسكس “السريرية الصف العزل أسلوب الإنسان”. زرع الكلي الصف مقني و perfused مع كولاجيناز عبر الشريان الكلوي (أ-ز) وتعليق الخلية الناتجة يتم غسلها وأما cryopreserved أو وضع في الثقافة (ح-ك). بعد إلى الخلايا كونفلوينسي (L)، أداء NG2 تخصيب خلية (M). الخلايا هي تريبسينيزيد عندما يكونون في متموجة، أما توقفت عن آخذة في التكاثر أو عند ظهور هياكل ثلاثية الأبعاد (N-P). معايير الإفراج عن كبسكس بالعقم وعلامة التعبير والقدرة على تعزيز الظهارية أنبوبي التئام الجروح (Q). السهم: شريان كلوي. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2: كبسكس “توصيف للبشرية”. ) كبسكس خلايا ملتصقة على شكل عمود الدوران، والبلاستيك. كبسكس ب) إيجابية بالنسبة لعلامات mesenchymal CD73، CD90، CD105، وعلامات ارتشاح NG2، بدجفر-β و CD146، بينما السلبية CD31 و CD34 و CD45. كبسكس التعبير عن الطبقة MHC أنا (هلا-ABC) ولكن ليس من الدرجة الثانية (هلا-د). ج) خصائص النمو من ثلاث جهات مانحة مختلفة كبسك من التدفق الخلوي وأكد متجانسة السكان إيجابية NG2 (في سن 4). كبسكس تصل إلى الشيخوخة حول مرور 9-10. كبسكس د) قادرين على تعزيز إصلاح الكلي الظهارية في مقايسة الصفر جرح. صور الممثل التحكم المتوسطة والمتوسطة كبسك مكيفة في t = 0، 4، 8 وتظهر ح 12. مقياس بار في A) = 200 مليميكرون، د) = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ارتشاح خلايا تم عزلها من كثير من البشرية الصلبة الأجهزة المختلفة، بما في ذلك البنكرياس والدهون والغضاريف والكلى^9،،من¹⁵¹⁶. ومع ذلك، معظم الأساليب، تستند إلى عينات صغيرة من الأنسجة، والتي يتم تشريح وبعدها تعامل مع إنزيمات الجهاز الهضمي. وعلاوة على ذلك، وهذا عادة ما لا يتم مع منتجات الصف السريرية. وهذا يجعل من هذه الاستراتيجيات أقل ملاءمة للترجمة السريرية المباشرة يلزم فيها كميات كبيرة من خلايا الصف السريرية.

هنا نعرض طريقة عزل رواية كبسكس البشرية للأجهزة كلها تستند إلى التروية مع الإنزيمات السريرية الصف والمواد. البروتوكول مقتبس من البروتوكول العزلة السريرية جزر لانجرهانز حاليا في استخدام التطبيق السريري في المركز لدينا¹⁸.

هذا هو الأسلوب الصف السريرية الأولى التي يمكن أن يتحقق فيها كميات كبيرة من كبسكس. التغير في العائد خلية هو إلى حد كبير من المانحين التابعة. ومع ذلك، عندما يتم استقراء العائد الخلية نحصل حاليا من جزء صغير من تعليق خلية النفط الخام من ثلاث جهات مانحة مختلفة، من الناحية النظرية، يمكن تحقيق متوسط إنتاج 2.7 × 10¹² كبسكس كل الجهات المانحة. كما ماجستير العلاج يتكون عادة من دفعات الخلية 2 مع 1-2 × 10⁶ خلايا للكيلوجرام، الجسم الوزن⁴، تكفي هذه الأرقام الخلية allogenic علاج العديد من المرضى.

واحد خطوة حاسمة في إجراءات العزل هي مدة الهضم كولاجيناز. عند فترة الهضم قصيرة جداً، سوف تظل كتل كبيرة من الأنسجة، التي ستكون أصعب للثقافة. عند فترة نضح طويل جداً، يمكن ملاحظة موت الخلية زيادة. ولذلك، حالما يبدأ الكلي لتصبح لينة والسوائل أقل شفافية، الكلي ينبغي أن يكون تدليك بلطف ومعاملة كولاجيناز يجب أن تتوقف.

خطوة حاسمة أخرى هي ثقافة الخلايا بعد تخصيب خلية في NG2. في بعض الأحيان بعد تخصيب خلية في NG2، لا تبدأ ارتشاح الخلايا تتكاثر أو تبدأ في النمو في هياكل ثلاثية الأبعاد. عندما تريبسينيزيد الخلايا وريسيديد، في هذه الحالة، سوف عادة ما تبدأ الخلايا تنمو في ثقافة أحادي الطبقة.

واستخدمت كبداية المواد، زرع الأعضاء البشرية الصف الكلي تجاهل أساسا لأسباب جراحية. هذه هي الأجهزة الفنية دون التليف الرئيسية. أننا نعترف بأن هذا قد يكون قيداً كهذا نادر نسبيا، ومن الصعب الحصول على مصدر الجهاز. اكسبلانتيد الكلي قد يكون مصدر آخر؛ بيد اعتماداً على السبب اكسبلانتيشن الكلي، هذه الكلي قد تحتوي على أكثر من التليف وميوفيبروبلاستس وهكذا، ولذلك ينبغي الحرص منذ ميوفيبروبلاستس قد تكون معزولة ومثقف بدلاً من ارتشاح الخلايا.

كما معزولة كبسكس مع هذا المعرض بروتوكول خصائص organo تيبيك مع الكلي الظهارية الجرح الشفاء قدرات¹⁵، العلاج بالخلايا مع كبسكس في أمراض الكلي وزرع الأعضاء سيكون تطبيق مستقبل مثيرة لاهتمام. ولهذا الغرض، هناك عدة استراتيجيات لتسليم المنتج/خلية. الاستراتيجية الأولى ضخ الرابع من كبسكس، كما تستخدم حاليا في الدراسات السريرية بممسك. تطبيق آخر للاهتمام هو استخدام كبسكس أو عوامل كبسك تفرز في نضح الجهاز قبل الزرع. بهذه الطريقة، يمكن تحسين نوعية الكلي اكسبلانتيد مما قد يؤدي إلى وظيفة الكلي تحسن بعد زرع الأعضاء. لكلتا الاستراتيجيتين، كبسكس، مصدر خلية جديدة مثيرة لاهتمام لمواصلة استكشاف للأغراض السريرية.

Materials

Baxter bags	Fenwal	R4R-7004
Human platelets	Sanquin		hospital surplus material expired for less than 2 days is used
platelet lysate			custom made
Disposable sterile bottles	Corning	09-761-11
500ml PP centrifuge tubes	Corning	431123
a-MEM medium	Lonza	BE12-169F
glutamax	thermo fisher	35050038
pen/strep	Invitrogen	15070063
transfusion system	Codan	455609
DMEM-F12	life technologies	11320-074
normal human serum	Sanquin
Hepes 1M	Lonza	BE-17-737E
NaHCO3 7.5%	Lonza	BE17-613E
CaCl2 1M	Sigma-Aldrich	10043-52-4
UW	Bridge to life	32911
Heparin	Leo Pharma
collagenase NB1 GMP grade	SERVA	17455.03
DMSO	Sigma Aldrich	D2650-100ml
surgical drapes	3M Nederland	DH999969404
perfusion pump	metrohm	x007528300
pump head	metrohm	x077202600
perfusion tray			custom made
LS25 masterflex tubes	Masterflex	HV-96410-25
accessory spike	Gambro DASCO	6038020
pulmozyme	Roche
culture flasks 25 cm2	greiner	690175
culture flask 75 cm2	greiner	658170
culture flask 175 cm2	greiner	661160
Trypsin	sigma	t4174
BSA	Sigma	A2153
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500g
FcR blocking reagent	miltenyi	130-059-901
anti melanoma beads (NG2)	miltenyi	130-090-452
cellstrainer 70 µm	Corning	352350
LS columns	Miltenyi	130-042-401
MACS magnet	miltenyi	130-090-976
CD34 FITC	BD	555821
CD45 APC	BD	555485
CD146 PE	BD	550315
NG2 APC	R&D	FAB2585A
CD90 PE	BD	555596
HLA ABC APC	BD	555555
CD105 FITC	Ancell	326-040
HLA DR APC	BD	559866
CD56 PE	BD	555516
CD73 PE	BD	550257
CD31 FITC	BD	555445
CD133 PE	miltenyi	130-090-853
PDGF-r	R&D	mab 1263
mouse IgG1 FITC	BD	345815
mouse IgG1 PE	BD	345816
mouse IgG1 APC	BD	345818
IgG2b PE	BD	555743
goat anti mouse PE	Dako	R0480
sodium azide	Merck	822335
DMEM Ham’s F12	Gibco	31331-028
ITS (insul, transferrin, selenium)	Sigma	I1884
hydrocortisone	Sigma	H0135
triiodothyrinine	Sigma	T5516
epidermal growth factor	sigma	E9644
Immortalized human renal PTEC (HK2)			courtesey of M. Ryan, university college Dublin