Her presenterer vi romanen klinisk klasse isolasjon og kultur metode for nyre Perivascular Stromal celler (kPSCs) basert på hele organ perfusjon fordøyelsesenzymer og NG2-celle berikelse. Med denne metoden er det mulig å skaffe tilstrekkelig cellen tallene for mobilnettet terapi.
Mesenchymal Stromal celler (MSCs) er vev homøostatisk og immunsystemet modulatory celler som har vist gunstige effekter i nyre sykdommer og transplantasjon. Perivascular Stromal celler (PSCer) deler egenskapene med benmarg MSCs (bmMSCs). Men har de, sannsynligvis lokale preging, vev-spesifikke egenskaper og spille en rolle i lokale vev homeostase. Denne vev spesifisitet kan resultere i bestemte reparasjon av vev, også innen human nyrene. Vi viste tidligere at menneskelige nyre PSCer (kPSCs) har forbedret nyre epithelial sårheling mens bmMSCs ikke har dette potensialet. Videre kan kPSCs forbedre nyre skader i vivo. Derfor utgjør kPSCs en interessant kilde for cellen terapi, spesielt for nyre sykdommer og nyre transplantasjon. Her viser vi detaljerte isolasjon og kultur metoden for kPSCs fra transplantasjon førsteklasses menneskets nyrer basert på hele organ perfusjon fordøyelsesenzymer via nyre arterien og berikelse for perivascular merket NG2. På denne måten kan stor celle mengder fås som er egnet for mobilnettet terapi.
Mesenchymal Stromal celler (MSCs) er modulatory immunceller som ble opprinnelig isolert fra benmargen. De er preget av sine spindel formet morfologi, evnen til å differensiere i fett, bein og brusk og plast etterlevelse. MSCs uttrykke stromal markører CD73, CD90, CD105 samtidig er negativt for markører CD31 og CD451,2,3. MSCs er en lovende kandidat for cellen terapi deres vev homøostatisk og immunmodulerende kapasiteter. bmMSCs er for tiden blir studert i kliniske studier for flere sykdommer, inkludert nyre sykdommer og nyre transplantasjon som vurderes andre steder4.
Tidligere ble det vist at perivascular celler fra flere forskjellige solide organer, inkludert fettvev, morkaken og skjelettlidelser muskel dele kjennetegn med MSCs9. Men utstillingen disse cellene også vev-spesifikke funksjoner som kan resultere i organotypic reparasjon10. Menneskelige hjerteinfarkt perivascular celler, for eksempel stimulerte angiogenic svar etter hypoksi og differensiert i cardiomyocytes, mens perivascular celler isolert fra andre vev ikke vise disse potensialene11.
Perivascular stromal celler kan også være isolert fra mus12,13,14 og menneskelige nyre15,16. Vi mye preget kPSCs og sammenlignet disse bmMSCs. Vi fant at kPSCs, ligner bmMSCs, har suppressive kapasitet og støtter vaskulære plexus formasjon. Det er imidlertid vev spesifikke forskjeller mellom celletyper, som kPSCs viste en organotypic transcriptional uttrykk signatur, inkludert de nephrogenic transkripsjonsfaktorer HoxD10 og HoxD11. kPSCs, i motsetning til bmMSCs, gjennomførte ikke myofibroblast transformasjon etter stimulering med TGF-β og var i stand til å skille ut adipocytter. Videre akselerert kPSCs epithelial integritet i en nyre rørformede epithelial såret scratch analysen, et fenomen som ikke ble observert med bmMSCs. Denne forbedrede sår reparasjon ble formidlet gjennom hepatocyte vekst faktor. Videre ameliorated kPSCs nyre skader i en musemodell av akutt nyre skader15. Derfor kPSCs synes å ha overlegen nyre reparasjon kapasiteter og er en interessant ny kilde for cellen terapi i nyre sykdommer.
For å kunne bruke kPSCs for cellen terapi, bør kPSCs bli isolert i en klinisk klasse måte med klinisk klasse enzymer og protokoller. Videre, for å kunne behandle flere pasienter med kPSCs fra 1 donor, tilstrekkelig celle tall kan skaffes. Her viser vi detaljert, klinisk klasse isolasjon prosedyren for kPSCs fra hele transplantasjon klasse nyrene, gir tilstrekkelig antall celler brukes til klinisk mobilnettet terapi.
Perivascular celler har vært isolert fra mange ulike menneskelige solide organer, inkludert bukspyttkjertelen, fett, brusk og nyre9,15,16. De fleste metoder, men er basert på små utvalg av vev, som er dissekert og etterpå behandles med fordøyelsesenzymer. Videre, dette er vanligvis ikke utført kliniske kvalitet produkter. Dette gjør disse strategiene mindre egnet for direkte klinisk oversettelse hvor store mengder av klinisk-grade celler er nødvendig.
Her viser vi en roman isolasjon metode for menneskelig kPSCs for hele organer basert på perfusjon med klinisk klasse enzymer og materialer. Protokollen er tilpasset fra klinisk holmer Langerhans isolasjon protokollen som brukes for klinisk anvendelse i vårt senter18.
Dette er den første kliniske klasse metoden der store mengder kPSCs kan oppnås. Variasjon i cellen avkastning er hovedsakelig donor avhengige. Men når cellen avkastningen vi nå få fra en brøkdel av råolje celle suspensjon av tre ulike givere er ekstrapolert, i teorien, kan en gjennomsnittlig avkastning på 2,7 x 1012 kPSCs per giver oppnås. Som MSC terapi vanligvis består av 2 cellen infusions med 1-2 x 106 celler/kg kroppen vekt4, er disse cellen tallene tilstrekkelig for allogenic behandling av flere pasienter.
En kritisk trinn i isolasjon prosedyren er den collagenase fordøyelsen. Når fordøyelsen perioden er for kort, blir store klumper av vev, som blir vanskeligere å kultur. Når Perfusjonsperiode er for lang, kan økt celledød observeres. Derfor nyre starter å bli myk og væsker mindre gjennomsiktig, nyre bør bli massert forsiktig og collagenase behandling bør stoppes.
Et annet viktig skritt er kulturen i cellene etter NG2 celle berikelse. Noen ganger etter den NG2 cellen berikelse starter perivascular cellene ikke sprer eller starte vokse i 3D strukturer. I dette tilfellet, når cellene er trypsinized og reseeded, begynner cellene vanligvis å vokse i monolayer kultur.
Som starter materiale, ble menneskelige transplantasjon Klasse nyrer forkastet hovedsakelig for kirurgiske grunner brukt. Dette er funksjonell organer uten store fibrose. Vi erkjenner at dette kan være en begrensning som dette er en relativt sjelden og vanskelig å få orgel kilde. Explanted nyrer kan være en annen kilde; imidlertid avhengig av grunnen av nyre explantation, disse nyrene kan inneholde flere fibrose og dermed myofibroblasts, og derfor må utvises forsiktighet siden myofibroblasts kunne være isolert og kultivert i stedet for perivascular celler.
Som kPSCs isolert med denne protokollen show organo-typic egenskaper med nyre epithelial sår helbredelse kapasitet15, cellen terapi med kPSCs i nyre sykdommer og transplantasjon ville være et interessant program som fremtidige. For dette formålet er det flere strategier av celle/celle produktlevering. Første strategi er IV infusjon av kPSCs, som brukes i dag i bmMSC kliniske studier. Et annet interessant program er bruk av kPSCs eller kPSC-utskilles faktorer i maskinen perfusjon før transplantasjon. På denne måten kan kvaliteten på explanted nyre forbedre som kan føre til forbedret nyrefunksjon etter transplantasjon. Begge strategier er kPSCs en interessant ny cellen kilde å utforske mer for klinisk formål.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen har mottatt finansiering fra EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under grant avtalenummer 305436 STELLAR.
Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 days is used | |
platelet lysate | custom made | ||
Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
500ml PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
transfusion system | Codan | 455609 | |
DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
normal human serum | Sanquin | ||
Hepes 1M | Lonza | BE-17-737E | |
NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
CaCl2 1M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
UW | Bridge to life | 32911 | |
Heparin | Leo Pharma | ||
collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
pump head | metrohm | x077202600 | |
perfusion tray | custom made | ||
LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
pulmozyme | Roche | ||
culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
Trypsin | sigma | t4174 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
cellstrainer 70 µm | Corning | 352350 | |
LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
CD34 FITC | BD | 555821 | |
CD45 APC | BD | 555485 | |
CD146 PE | BD | 550315 | |
NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
CD90 PE | BD | 555596 | |
HLA ABC APC | BD | 555555 | |
CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
HLA DR APC | BD | 559866 | |
CD56 PE | BD | 555516 | |
CD73 PE | BD | 550257 | |
CD31 FITC | BD | 555445 | |
CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
IgG2b PE | BD | 555743 | |
goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
sodium azide | Merck | 822335 | |
DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
ITS (insul, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
epidermal growth factor | sigma | E9644 | |
Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |