Echocardiographic और ऊतकीय माउस में कार्डियक आकृति विज्ञान की परीक्षा
Summary
Echocardiographic परीक्षा अक्सर चूहों में प्रयोग किया जाता है । इस प्रयोजन के लिए महँगे उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाले अल्ट्रासाउंड यंत्र विकसित किए गए हैं. इस प्रोटोकॉल एक किफायती echocardiographic ऊतकीय morphometric विश्लेषण के साथ संयुक्त प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए कार्डियक आकृति विज्ञान का निर्धारण ।
Abstract
आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की एक बढ़ती हुई संख्या हाल के वर्षों में उपलब्ध हो गया है । इसके अलावा, चूहों में किए गए औषधीय अध्ययनों की संख्या अधिक है । Phenotypic इन माउस मॉडल के लक्षण वर्णन भी कार्डियक फंक्शन और आकृति विज्ञान की परीक्षा की आवश्यकता है । इकोकार्डियोग्राफी और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) आमतौर पर चूहों में कार्डियक समारोह और आकृति विज्ञान की विशेषता के दृष्टिकोण का इस्तेमाल कर रहे हैं । Echocardiographic और एमआरआई छोटे कुतर में उपयोग के लिए विशेष उपकरण महंगा है और एक समर्पित अंतरिक्ष की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल एक 15 मेगाहर्ट्ज मानव संवहनी जांच के साथ एक नैदानिक echocardiographic प्रणाली का उपयोग चूहों में कार्डियक माप का वर्णन. माप anesthetized वयस्क चूहों पर प्रदर्शन कर रहे हैं. न्यूनतम तीन छवि अनुक्रम दर्ज की गई और parasternal लघु अक्ष दृश्य में एम मोड में प्रत्येक जानवर के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. बाद में, कार्डिएक ऊतकीय परीक्षा किया जाता है, और cardiomyocyte व्यास hematoxylin-eosin-या गेहूं के बीज agglutinin (WGA)-सना हुआ आयल वर्गों पर निर्धारित कर रहे हैं । पोत घनत्व Pecam-1 immunostaining के बाद morphometrically निर्धारित किया जाता है । प्रोटोकॉल आधारभूत स्थितियों के तहत औषधीय अध्ययन और विभिंन आनुवंशिक पशु मॉडलों को सफलतापूर्वक लागू किया गया है, साथ ही साथ बाईं पूर्वकाल उतरते कोरोनरी धमनी के स्थाई बंधाव द्वारा प्रयोगात्मक रोधगलन के बाद ( लाड). हमारे अनुभव में, echocardiographic जांच anesthetized पशुओं तक ही सीमित है और वयस्क चूहों में ंयूनतम 25 ग्राम वजन संभव है ।
Introduction
आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की एक बड़ी विविधता उपलब्ध हैं, और चूहों में औषधीय अध्ययन की संख्या उच्च है1,2. इकोकार्डियोग्राफी और एमआरआई आमतौर पर इन माउस मॉडल में कार्डियक फंक्शन और आकृति विज्ञान के phenotypic लक्षण वर्णन के लिए दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं3. प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य कार्डियक समारोह और वयस्क चूहों में आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए है । यह echocardiographic, ऊतकीय, और immunohistochemical माप को जोड़ती है । Echocardiographic परीक्षा व्यापक रूप से चूहों में प्रयोग किया जाता है4,5,6,7,8,9,10,11, 12. पाचों एट अल. 11 की पहचान २०५ संचलनमें प्रकाशित अध्ययन, संचलन अनुसंधान, शरीर विज्ञान के अमेरिकन जर्नल-दिल और संचार फिजियोलॉजी, और २०१२ और २०१५ के बीच हृदय अनुसंधान कि पशुओं में echocardiographic परीक्षा का प्रयोग किया ।
इकोकार्डियोग्राफी आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में कार्डियक phenotypes की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पुरानी अधिभार प्रेरित अतिवृद्धि, रोधगलन ischemia, और चूहों में cardiomyopathy मॉडल में कार्डियक समारोह का विश्लेषण (12में समीक्षा की) । सुधारित इकोकार्डियोग्राफी उपकरण बाएँ-वेंट्रिकुलर (एल. वी.) सिस्टोलिक और डायस्टोलिक आयामों, टिशू डॉप्लर इमेजिंग, रोधगलन कंट्रास्ट echography के मानक उपाय और LV क्षेत्रीय समारोह और कोरोनरी रिजर्व के आकलन के लिए अनुमति देता है 12. आदर्श रूप में, echocardiographic परीक्षा सिकुड़ा समारोह पर संज्ञाहरण के नकारात्मक प्रभाव से बचने के लिए जागरूक चूहों में किया जाना चाहिए, स्वायत्त पलटा नियंत्रण, और दिल की दर11. फिर भी, इस दृष्टिकोण की आवश्यकता द्वारा सीमित है जानवरों को प्रशिक्षित करने के लिए; शरीर का तापमान स्थिर रखने में कठिनाइयां; आंदोलन कलाकृतियों; तनाव; बहुत उच्च हृदय आवृत्तियों; और जरूरत से कम दो जांचकर्ताओं के लिए प्रयोग करने के लिए, खासकर अगर पशुओं की एक बड़ी संख्या में जांच कर रहे हैं । दिलचस्प बात यह है कि हाल के एक अध्ययन में प्रशिक्षित और अप्रशिक्षित पशुओं में echocardiographic मापदंडों में कोई अंतर नहीं19बताया गया है । हम anesthetized चूहों में echocardiographic माप प्रदर्शन करते हैं । अलग संज्ञाहरण प्रोटोकॉल के नीचे चर्चा की जाएगी ।
हालांकि मानक रिज़ॉल्यूशन इकोकार्डियोग्राफी (& #62; 10 MHz) वयस्क चूहों में LV सिस्टोलिक और डायस्टोलिक आयामों और कार्डियक फंक्शन को मापने के लिए पर्याप्त है, विधि अंतर्निहित संरचनात्मक घटना के अपने वर्णन में सीमित है । इस प्रकार, हम ऊतकीय और immunohistological विश्लेषण के साथ vivo माप में गठबंधन को मापने के लिए, उदाहरण के लिए, cardiomyocyte व्यास और पोत घनत्व । अन्य ऊतकीय और immunohistological जांच, जैसे प्रसार के निर्धारण, apoptosis की परीक्षा, infarct आकार माप, फाइब्रोसिस का निर्धारण, और विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति, के एक ही प्रकार पर भी किया जा सकता है संसाधित ऊतक लेकिन इस प्रोटोकॉल का विषय नहीं हैं । ऊतकीय विश्लेषण के साथ vivo echocardiographic परीक्षा में संयोजन अंतर्निहित संरचनात्मक परिवर्तन में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । एक अतिरिक्त कदम में, हम आणविक और अल्ट्रा संरचनात्मक जांच के साथ इन माप को पूरा कर सकते हैं । ऊतकीय िरा न केवल echocardiographic परीक्षा पूरी करता है बल्कि अपरिहार्य भी बन जाता है जब इकोकार्डियोग्राफी का संकल् प पर्याप् त न हो । यह विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों कि भ्रूण घातक23,24के मॉडल में मामला है ।
Protocol
यहां वर्णित प्रयोगों को प्रासंगिक संस्थागत और फ्रांसीसी पशु कल्याण कानूनों, दिशानिर्देशों और नीतियों के अनुपालन में किया गया था । इन्हें फ्रांसीसी आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है (Comit & #233; Institutio…
Representative Results
Discussion
विभिंन तरीकों इकोकार्डियोग्राफी, इसके विपरीत-बढ़ाया एमआरआई, माइक्रो सीटी, और पीईटी स्कैन सहित चूहों में कार्डियक संरचना और समारोह का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया है । अपनी लागत प्रभावशीलता ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम फ्रांसीसी सरकार द्वारा समर्थित किया गया था (राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी, ANR) “भविष्य के लिए निवेश के माध्यम से” LABEX SIGNALIFE कार्यक्रम (संदर्भ ANR-11-LABX-0028-01) और संघ से K. D. W करने के लिए अनुदान द्वारा ला सूक्ष्म सुर le कैंसर, शौकीनों डी फ्रांस, और योजना कैंसर Inserm । डी. बी. और ए. वी. प्राप्त फैलोशिप से स्नेहा डालो ला सूक्ष्म Médicale और नीस के शहर से, क्रमशः. echocardiograph और transducer कृपया फिलिप्स द्वारा प्रदान की गई । हम उनके कुशल तकनीकी सहायता के लए ए. Borderie, एस. Destree, एम. Cutajar-Bossert, ए. Landouar, ए. Martres, ए. Biancardini, और एस. एम. Wagner का धन्यवाद करते हैं.
Materials
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
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