Echokardiographische und histologische Untersuchung der kardiale Morphologie in der Maus
Summary
Echokardiographische Untersuchung wird häufig bei Mäusen verwendet. Teure hochauflösende Ultraschall-Geräte wurden für diesen Zweck entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt eine erschwingliche echokardiographische Verfahren kombiniert mit histologischen morphometrische Analysen kardiale Morphologie zu bestimmen.
Abstract
Eine wachsende Zahl von genetisch veränderten Mäusen ist verfügbar in den letzten Jahren geworden. Darüber hinaus ist die Anzahl der pharmakologischen Studien an Mäusen hoch. Phänotypischen Charakterisierung dieser Maus-Modelle erfordert auch die Untersuchung der Herzfunktion und Morphologie. Echokardiographie und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) sind häufig verwendete Ansätze Herzfunktion und Morphologie bei Mäusen zu charakterisieren. Echokardiographische und MRT-Geräte spezialisiert für den Gebrauch in kleinen Nagetieren ist teuer und erfordert einen eigenen Platz. Dieses Protokoll beschreibt kardiale Messungen bei Mäusen mit einem klinischen echokardiographische System mit einer menschlichen Kreislauf 15 MHz-Sonde. Messungen werden an narkotisierten erwachsenen Mäusen durchgeführt. Mindestens drei Bildsequenzen werden aufgezeichnet und analysiert für jedes Tier im M-Modus in der Parasternal kurze Achse Ansicht. Danach kardiologische histologische Untersuchung wird durchgeführt, und Cardiomyocyte Durchmesser richten sich auf Hämatoxylin-Eosin oder Weizenkeime Agglutinin (WGA)-gebeizt Paraffin Abschnitte. Schiff-Dichte ist bestimmt Morphometrically nach Pecam-1 Immunostaining. Das Protokoll wurde erfolgreich auf pharmakologische Studien angewendet und verschiedene genetische Tiermodellen unter geplanten Bedingungen sowie nach experimentellen Myokardinfarkt durch die dauerhafte Unterbindung des linken vorderen absteigenden Koronararterie ( (LAD). Nach unserer Erfahrung echokardiographische Untersuchung beschränkt sich auf narkotisierten Tiere und ist machbar in erwachsener Mäuse mit einem Gewicht von mindestens 25 g.
Introduction
Gibt es eine Vielzahl von genetisch veränderten Mäusen, und die Anzahl der pharmakologischen Studien an Mäusen ist hoch1,2. Echokardiographie und MRT sind häufig verwendete Ansätze zur phänotypischen Charakterisierung der Herzfunktion und Morphologie in diese Maus-Modelle-3. Das Ziel des vorliegenden Protokolls ist, Herzfunktion und Morphologie bei Erwachsenen Mäusen zu analysieren. Es verbindet echokardiographische, histologischen, und immunhistochemische Messungen. Echokardiographische Untersuchung ist in Mäusen4,5,6,7,8,9,10,11verbreitet, 12. Pachon Et al. 11 identifiziert 205 Studien veröffentlicht in Umlauf, Zirkulation Forschung, American Journal of Physiology – Herz und Herz-Kreislauf Physiologieund Herz-Kreislauf-Forschung zwischen 2012 und 2015 echokardiographische Untersuchung bei Tieren verwendet.
Die Echokardiographie dient zur Identifizierung kardiale Phänotypen in genetisch veränderte Mäuse,5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, sowie der Herzfunktion in chronische Überlastung-induzierte Hypertrophie, Myokardischämie und Kardiomyopathie Modelle bei Mäusen (rezensiert in12) zu analysieren. Verbesserte Echokardiographie Ausrüstung ermöglicht es, für die das Standardmaß von links-ventrikuläre (LV) systolischen und diastolischen Dimensionen, Gewebe-Doppler-Bildgebung, myokardiale Kontrast Sonografie und die Beurteilung der LV Regionalfunktion und koronare Reserve 12. im Idealfall echokardiographische Untersuchung durchgeführt werden sollte, im bewussten Mäuse, die negativen Auswirkungen der Narkose auf kontraktile Funktion, autonome reflex Kontrolle zu vermeiden und Herzfrequenz11. Dennoch wird dieser Ansatz durch das Erfordernis, die Tiere zu trainieren begrenzt; Schwierigkeiten die Körpertemperatur stabil zu halten; Bewegungsartefakte; Stress; sehr hohe Herz Frequenzen; und die Forderung für mindestens zwei Ermittler das Experiment durchführen, vor allem, wenn eine große Anzahl von Tieren untersucht werden. Eine aktuelle Studie berichtet Interessanterweise keine Unterschiede in der echokardiographische Parameter in trainierten und untrainierten Tiere19. Wir führen echokardiographische Messungen bei narkotisierten Mäusen. Verschiedenen Anästhesie Protokolle werden unten besprochen.
Obwohl Standardauflösung Echokardiographie (> 10 MHz) ist ausreichend, um Maßnahme LV systolischen und diastolischen Dimensionen und Herzfunktion bei Erwachsenen Mäusen, die Methode ist in seiner Beschreibung der zugrunde liegende strukturelle Phänomene begrenzt. So verbinden wir die in-Vivo -Messungen mit histologischen und Immunohistologische Analysen, z. B. Cardiomyocyte Durchmesser und Schiff Dichte zu messen. Andere histologischen und Immunohistologische Untersuchungen, wie z. B. die Bestimmung der Proliferation, Prüfung der Apoptose, Infarkt Größenmessungen, Bestimmung der Fibrose und spezifische Marker Ausdruck können auch auf die gleiche Art von erfolgen Gewebe verarbeitet, aber sind nicht Gegenstand dieses Protokolls. Die Kombination von in Vivo echokardiographische Untersuchung mit histologischen Analysen bietet weitere Einblicke in die zugrunde liegende strukturelle Veränderungen. In einem weiteren Schritt können wir diese Messungen mit molekularen und Ultra-strukturelle Untersuchungen durchführen. Histologische Analysen nicht nur die echokardiographische Untersuchung sondern auch unverzichtbar geworden, wenn die Auflösung der Echokardiographie nicht ausreichend ist. Dies gilt vor allem für Modelle von genetisch veränderten Mäusen, die embryonale tödliche23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um kardiale Struktur und Funktion bei Mäusen, einschließlich Echokardiographie, Kontrast-verstärkte MRI, Mikro-CT und PET-Scan zu bewerten. Aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit und Einfachheit ist Echokardiographie die am weitesten verbreitete Technik zur Funktionsanalyse in Mäusen11. In der Regel wegen der geringen Größe des Herzens und der hohen Frequenz der Herzfrequenz bei Mäusen, Wandler mit einer Frequenz > 10 MHz sollte verwendet werden, obw…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde von der französischen Regierung (National Research Agency, ANR) durch das Programm “Investitionen für die Zukunft” LABEX SIGNALIFE (Referenz ANR-11-LABX-0028-01) unterstützt und durch Zuschüsse, K. D. W. von der Association pour la Recherche Sur le Cancer Fondation de France, und planen Sie Krebs Inserm. D. B. und A. V. Feldkamp von der Fondation Pour la Recherche Médicale und von der Stadt Nizza, beziehungsweise. Die Echokardiograph und der Wandler wurden uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Philips. Wir danken A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini und S. M. Wagner für ihre qualifizierte technische Unterstützung.
Materials
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
Riferimenti
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