Kardiyak Morfoloji Ekokardiyografik ve histolojik muayene fare
Summary
Ekokardiyografik inceleme farelerde sık sık kullanılır. Bu amaç için pahalı yüksek çözünürlüklü ultrason cihazları geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı histolojik xarakteristikaları analizler ile kardiyak Morfoloji belirlemek için birlikte uygun fiyatlı bir Ekokardiyografik yordamı açıklar.
Abstract
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri artan sayıda son yıllarda kullanılabilir hale gelmiştir. Ayrıca, farmakolojik çalışmalar farelerde gerçekleştirilen sayısı yüksektir. Bu fare modelleri fenotipik karakterizasyonu de kardiyak fonksiyon ve Morfoloji incelenmesi gerekir. Ekokardiyografi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kardiyak fonksiyon ve Morfoloji farelerde karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar vardır. Küçük kemirgen kullanımda ve pahalı bir özel alanı gerektirir için Ekokardiyografik ve MRI donanımları uzman. Bu iletişim kuralı bir 15 MHz insan vasküler sonda ile klinik bir Ekokardiyografik sistemiyle farelerde kardiyak ölçüleri açıklar. Ölçümler imzalat yetişkin fareler üzerinde gerçekleştirilir. En az üç görüntü sıralarını kaydedilir ve her hayvan için M-modu parasternal kısa eksenli görünümünde analiz. Daha sonra kardiyak histolojik inceleme yapılır ve cardiomyocyte çapları Hematoksilen üzerinde belirlenir-Eozin – ya da buğday tohumu agglutinin (WGA)-parafin kesitler lekeli. Gemi kararlı morphometrically Pecam-1 immunostaining sonra yoğunluğudur. Protokol farmakolojik çalışmalar başarıyla uygulanan ve farklı genetik hayvan modelleri temel koşullar altında hem de deneysel akut miyokard infarktüsü sol ön inen koroner arter (kalıcı ligasyonu tarafından sonra oldu ÇOCUK). Bizim deneyim, Ekokardiyografik inceleme imzalat hayvanlara sınırlıdır ve en az ağırlığında yetişkin farelerde uygulanabilirdir 25 gr.
Introduction
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, büyük bir çeşitlilik vardır ve farmakolojik çalışmalar farelerde yüksek1,2sayısıdır. Ekokardiyografi ve MRI kardiyak fonksiyon ve Morfoloji bu fare modelleri3fenotipik karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar vardır. Amacı sunulan protokolü, kardiyak fonksiyon ve Morfoloji yetişkin farelerde analiz etmektir. Ekokardiyografi, histolojik, birleştirir ve immunohistokimyasal ölçümleri. Ekokardiyografik inceleme fareler4,5,6,7,8,9,10,11‘yaygın olarak kullanılır, 12. Pachon vd. 205 çalışmalar kan dolaşımı, Kan dolaşımı araştırma, Amerikan Journal Fizyoloji – kalp ve dolaşım fizyolojisive Kardiyovasküler araştırma 2.012 ve 2015 ki arasında yayınlanan 11 tespit Ekokardiyografik inceleme hayvanlarda kullanılan.
Ekokardiyografi kalp fenotipleri genetiği değiştirilmiş fare5,6,13,14,15,16, tanımlamak için kullanılır 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , kronik aşırı kaynaklı hipertrofisi, miyokardiyal iskemi ve kardiyomiyopati modelleri (12incelendi) farelerde kardiyak fonksiyon analiz olarak 22, de. Geliştirilmiş Ekokardiyografi cihazları bırakmak için standart ölçü birimi (LV) sol ventrikül sistolik ve diyastolik boyutların, doku Doppler görüntüleme, miyokardiyal kontrast echography ve LV bölgesel fonksiyon ve koroner rezerv değerlendirilmesi 12. ideal olarak, Ekokardiyografik inceleme bilinçli farelerde contractile işlev, otonomik refleks kontrolü, anestezi olumsuz etkilerini önlemek için gerçekleştirilmesi ve kalp hızı11. Bununla birlikte, bu yaklaşım hayvanları eğitmek için gereksinimin tarafından sınırlıdır; vücut ısısı istikrarlı tutmak zorlukları; hareket eserler; stres; çok yüksek kardiyak Frekanslar; ve özellikle çok sayıda hayvan soruşturma altında iseniz deneme, gerçekleştirmek en az iki müfettişler gereksinimi. İlginçtir, bir çalışmada eğitimli ve eğitimsiz hayvanlar19Ekokardiyografik parametreler yok farklılıkları bildirdi. Ekokardiyografik ölçümlere imzalat farelerde gerçekleştiriyoruz. Farklı anestezi protokoller aşağıda ele alınacaktır.
Her ne kadar standart çözünürlük Ekokardiyografi (> 10 MHz) olduğunu ölçü LV sistolik ve diyastolik boyutlar ve kardiyak fonksiyon yetişkin farelerde yeterli, belgili tanımlık yöntem açıklamasını temel yapısal olayları sınırlıdır. Böylece, biz vivo ölçümleri ile histolojik birleştirmek ve immunohistological analizler, örneğin, cardiomyocyte çap ve gemi yoğunluğunu ölçmek için. Nükleer silahların yayılmasına karşı belirlenmesi, sınav apoptosis, enfarktüsü boyut ölçüleri, fibrozis ve belirli işaret ifade, belirlenmesi gibi diğer histolojik ve immunohistological araştırmalar da aynı tür üzerinde gerçekleştirilebilir doku işlenen ama bu protokol konusu değildir. Vivo Ekokardiyografik inceleme histolojik analizler ile kombinasyonu temel yapısal değişiklikler ilgili ek bilgiler sağlar. Ek bir adım olarak, bu ölçümler moleküler ve ultra yapısal İncelemeler ile tamamlayabilirsiniz. Histolojik analizler sadece Ekokardiyografik inceleme tamamlamak ama Ekokardiyografi çözünürlük yeterli olmadığında da vazgeçilmez olmak. Bu özellikle modelleri genetiği değiştirilmiş farelerin embriyonik öldürücü23,24olan durumdur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kardiyak yapısı ve fonksiyonu farelerde, Ekokardiyografi, kontrast-artırılmış MRI, CT mikro ve PET taraması gibi değerlendirmek için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Maliyet-etkililik ve kolaylık nedeniyle Ekokardiyografi fareler11fonksiyonel analiz için en çok kullanılan tekniktir. Genel olarak, kalp ve nabız farelerde, dönüştürücü bir frekans ile yüksek frekans küçük boyutu nedeniyle > 10 MHz kullanılmalıdır, her ne kadar başarılı ölçümleri 8 ya da 9 MH…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma “Yatırımlar gelecek için” LABEX SIGNALIFE program sayesinde (başvuru ANR-11-LABX-0028-01) (Ulusal araştırma ajansı, ANR) Fransız hükümeti tarafından desteklenen ve K. hibe tarafından Derneği’nden D. W. pour la Recherche sur le kanser, Fondation de France ve kanser INSERM planı. D. B. ve A. V. Arkadaş grupları sırasıyla Fondation pour la Recherche Médicale ve Nice şehir aldı. Philips tarafından sağlanan echocardiograph ve dönüştürücü nazik idi. A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Karatepe, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini ve S. M. Wagner onların yetenekli teknik yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
Riferimenti
- Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
- Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
- Phoon, C. K., Turnbull, D. H. Cardiovascular Imaging in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).
- Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
- Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
- Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
- Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
- de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
- Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
- Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
- Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
- Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
- Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
- Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
- Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
- Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, S124-S129 (2011).
- Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
- Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
- Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
- Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms’ tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms’ tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
- Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
- Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
- Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
- van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms’ tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
- Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
- Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
- Ismail, J. A., et al. Immunohistologic labeling of murine endothelium. Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).
- Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
- Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
- Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).
