Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali
Summary
Questo studio presenta una tecnica per l'isolamento dei neuroni da topi neonatali WT. Richiede l'attenta disezione del midollo spinale dal topo neonatale, seguita dalla separazione dei neuroni dal tessuto del midollo spinale attraverso la scissione meccanica ed enzimatica.
Abstract
Presentiamo un protocollo per l'isolamento e la cultura dei neuroni del midollo spinale. I neuroni sono ottenuti da topi neonatali C57BL / 6 e sono isolati nel giorno postnatalo 1-3. Un cucciolo di topo, di solito 4-10 cuccioli nati da una coppia di allevamento, viene raccolto per un esperimento e le corde spinali vengono raccolte individualmente da ciascun mouse dopo eutanasia con isoflurano. La colonna vertebrale viene disseccata e poi il midollo spinale viene rilasciato dalla colonna. I cavi spinali vengono quindi macinati per aumentare la superficie di consegna per una proteasi enzimatica che consente di liberare i neuroni e altre cellule dal tessuto. La triturazione viene poi usata per liberare le cellule in soluzione. Questa soluzione viene successivamente frazionata in un gradiente di densità per separare le varie cellule in soluzione, consentendo il isolamento dei neuroni. Circa 1-2,5 x 10 6 neuroni possono essere isolati da un gruppo di letti. I neuroni vengono poi seminati su pozzetti rivestiti di facto adesivoR che permettono una corretta crescita e maturazione. I neuroni richiedono circa 7 giorni per raggiungere la maturità nel mezzo di crescita e coltura e possono poi essere utilizzati per il trattamento e l'analisi.
Introduction
La comprensione della patologia del midollo spinale richiede l'uso di vari modelli, sia a livello macroscopico che microscopico. I modelli animali grandi e piccoli 1 , 2 , 3 sono usati per le indagini in vivo di malattie del midollo spinale e lesioni. Mentre studia questi problemi in vivo ha i suoi meriti, l'analisi del midollo spinale è limitata all'intero homogenato del midollo spinale o alle sezioni del tessuto 4 . Ciò crea qualche ambiguità quando si cerca di isolare risposte e obiettivi specifici nel midollo spinale tra i neuroni residenti e la loro regione circostante. La crescente disponibilità di topi manipolati geneticamente permette di effettuare approfondite indagini sulla biologia a livello cellulare e molecolare. Pertanto, qui viene utilizzato un modello del topo neonatale, che consente lo studio delle proprietà uniche e della biologia dei neuroni del midollo spinale in vitro .
L'isolamento e la manutenzione dei neuroni in vitro non è particolarmente diretto. Esiste una abbondanza relativa di tecniche per l'isolamento dei neuroni dal tessuto corticale dei roditori adulti che sembrano provocare un numero considerevole di neuroni isolati ( ossia milioni) 5 , 6 , 7. Al contrario, la resa dei neuroni dal tessuto del midollo spinale è inferiore a 8 , 9 , 10 , in parte dovuta alla più piccola massa di tessuto. Inoltre, nei topi c'è una relativa poca tecnica di isolamento dei neonatali I neuroni del midollo spinale ei metodi esistenti sono limitati da rese inferiori ai neuroni ( cioè centinaia) 9 o tecniche laboriose e pesanti che richiedono l'isolamento dei topi embrionali 10 .In questo protocollo, noiUtilizzare una tecnica che consente l'isolamento costoso ed efficace di un numero considerevole di neuroni dai cavi spinali di topi neonatali. Come è comune nelle tecniche precedentemente pubblicate, utilizziamo il papain come una proteasi enzimatica, che consente il rilascio di neuroni dal tessuto del midollo spinale 5 , 6 . Inoltre, utilizziamo un gradiente di densità per la separazione delle cellule raffinate, che è stato precedentemente dimostrato essere efficace 6 , 10 . Mentre il mezzo in cui le cellule sono incubate può variare, nella nostra esperienza e come pubblicato in precedenza 11 , l'integrazione con supplemento di terreno di coltura fresco B27 è risultato essere critico per la longevità del neurone. I neuroni sono tipicamente vitali per un massimo di 10 giorni, permettendo di eseguire il trattamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa tecnica consente la cultura affidabile dei neuroni del midollo spinale. Una volta raggiunta la conoscenza della tecnica, ci vogliono circa 3,5 ore per completare. Siamo stati in grado di effettuare l'isolamento dei neuroni da 2 cucciolate separate (16 topi totali) in circa 4 h. Il passo fondamentale della fattibilità è poter estrarre efficacemente i cavi spinali dai topi. La resa consente di plating diversi pozzetti e per la capacità di testare i neuroni in varie condizioni. Siamo stati in grado di trattar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori non hanno alcun riconoscimento.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
Riferimenti
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