L'isolement et la culture des neurones de la moelle épinière chez les souris néonatales
Summary
Cette étude présente une technique pour l'isolement des neurones de la souris néonatale WT. Il nécessite une dissection soigneuse de la moelle épinière de la souris néonatal, suivie de la séparation des neurones du tissu de la moelle épinière par un clivage mécanique et enzymatique.
Abstract
Nous présentons un protocole pour l'isolement et la culture des neurones de la moelle épinière. Les neurones sont obtenus à partir de souris C57BL / 6 néonatales et sont isolés le 1er jour post-natal. Une litière de souris, habituellement 4-10 chiots nés d'une paire de reproduction, est recueillie pour une expérience, et les moelle épinières sont collectées individuellement de chaque souris après l'euthanasie avec de l'isoflurane. La colonne vertébrale est disséquée et la moelle épinière est libérée de la colonne. Les moelle épinières sont alors émincées pour augmenter la surface d'accouchement pour une protéase enzymatique qui permet aux neurones et autres cellules de sortir du tissu. La trituration est ensuite utilisée pour libérer les cellules en solution. Cette solution est ensuite fractionnée dans un gradient de densité pour séparer les différentes cellules en solution, ce qui permet d'isoler les neurones. Environ 1-2,5 x 10 6 neurones peuvent être isolés d'un groupe de litière. Les neurones sont ensuite ensemencés sur des puits recouverts d'adhérentsQui permettent une croissance et une maturation appropriées. Les neurones prennent environ 7 jours pour atteindre la maturité dans le milieu de croissance et de culture et peuvent être utilisés par la suite pour le traitement et l'analyse.
Introduction
La compréhension de la pathologie de la moelle épinière nécessite l'utilisation de divers modèles, à la fois sur les niveaux macroscopique et microscopique. Les modèles grand et petit animal 1 , 2 , 3 sont utilisés pour des recherches in vivo de la maladie de la moelle épinière et des blessures. Tout en étudiant ces problèmes in vivo a ses mérites, l'analyse de la moelle épinière est limitée à l'homogénat de la moelle épinière entière ou aux sections de tissu 4 . Cela crée une certaine ambiguïté en essayant d'isoler des réponses et des cibles spécifiques dans la moelle épinière parmi ses neurones résidents et la glande environnante. La disponibilité croissante de souris manipulées génétiquement permet des recherches plus détaillées de la biologie aux niveaux cellulaire et moléculaire. Ainsi, un modèle de souris néonatal est utilisé ici, ce qui permet d'étudier les propriétés uniques et la biologie des neurones de la moelle épinière in vitro .
L'isolement et le maintien des neurones in vitro ne sont pas particulièrement simples. Il existe une abondance relative de techniques d'isolement des neurones du tissu cortical des rongeurs adultes qui semblent entraîner un nombre important de neurones isolés ( c'est-à-dire des millions) 5 , 6 , 7. En revanche, le rendement des neurones du tissu de la moelle épinière est inférieur à 8 , 9 , 10 , en partie à cause de la plus petite masse de tissu. En outre, chez les souris, il existe une relative pénurie de techniques d'isolement néonatal Les neurones de la moelle épinière et les méthodes existantes sont limitées par des rendements inférieurs des neurones ( c.-à-d. Des centaines) 9 ou des techniques laborieuses et lourdes nécessitant l'isolement de souris embryonnaires 10 .Dans ce protocole, nousUtiliser une technique qui permet l'isolement efficace des coûts et des ressources d'un nombre important de neurones provenant de la moelle épinière de souris néonatales. Comme c'est fréquent dans les techniques publiées précédemment, nous utilisons la papaïne comme protéase enzymatique, ce qui permet la libération de neurones du tissu de la moelle épinière 5 , 6 . En outre, nous utilisons un gradient de densité pour la séparation des cellules raffinées, qui a précédemment été efficace 6 , 10 . Alors que le milieu dans lequel les cellules sont incubées peut varier, dans notre expérience et tel que précédemment publié 11 , la supplémentation avec un supplément de milieu de culture B27 frais s'est révélée critique pour la longévité des neurones. Les neurones sont généralement viables jusqu'à 10 jours, ce qui permet d'effectuer un traitement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette technique permet une culture fiable des neurones de la moelle épinière. Une fois que la maîtrise de la technique est atteinte, il faut environ 3,5 h pour compléter. Nous avons pu effectuer l'isolement des neurones à partir de 2 larves séparées (16 prises de souris) en environ 4 h. L'étape clé de la faisabilité est de pouvoir extraire efficacement les cordes vertébrales des souris. Le rendement permet de plaquer plusieurs puits et de pouvoir tester les neurones dans diverses conditions. Nous avon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n'ont aucune reconnaissance.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
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