Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen
Summary
Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung.
Abstract
Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Kultur der Rückenmark Neuronen. Die Neuronen werden aus neonatalen C57BL / 6-Mäusen gewonnen und sind am postnatalen Tag 1-3 isoliert. Ein Mausstreu, in der Regel 4-10 Welpen aus einem Zuchtpaar geboren, ist für ein Experiment gesammelt, und Wirbelsäule werden einzeln von jeder Maus nach Euthanasie mit Isofluran gesammelt. Die Wirbelsäule wird ausgeschnitten und dann wird das Rückenmark aus der Säule entnommen. Die Wirbelsäule werden dann gehackt, um die Oberfläche der Abgabe für eine enzymatische Protease zu erhöhen, die es ermöglicht, dass die Neuronen und andere Zellen aus dem Gewebe freigesetzt werden. Trituration wird dann verwendet, um die Zellen in Lösung freizusetzen. Diese Lösung wird anschließend in einem Dichtegradienten fraktioniert, um die verschiedenen Zellen in Lösung zu trennen, wodurch Neuronen isoliert werden können. Etwa 1-2,5 x 10 6 Neuronen können aus einer Wurfgruppe isoliert werden. Die Neuronen werden dann auf mit Klebstoff beschichteten Wells ausgesätRs, die für ein angemessenes Wachstum und Reifung zu ermöglichen. Die Neuronen dauern ca. 7 Tage, um die Reife im Wachstums- und Kulturmedium zu erreichen und können danach zur Behandlung und Analyse verwendet werden.
Introduction
Das Verständnis der Rückenmarkpathologie erfordert die Verwendung verschiedener Modelle, sowohl auf makroskopischer als auch auf mikroskopischer Ebene. Große und kleine Tiermodelle 1 , 2 , 3 werden für in vivo Untersuchungen von Rückenmarkserkrankungen und Verletzungen verwendet. Während das Studium dieser Probleme in vivo hat seine Verdienste, ist die Analyse des Rückenmarks auf ganze Rückenmark-Homogenat oder Gewebe-Abschnitte 4 begrenzt . Dies schafft eine gewisse Unklarheit beim Versuch, spezifische Reaktionen und Ziele im Rückenmark unter seinen residenten Neuronen und umgebenden Glia zu isolieren. Die zunehmende Verfügbarkeit von genetisch manipulierten Mäusen ermöglicht detailliertere Untersuchungen der Biologie auf zellulärer und molekularer Ebene. So wird hier ein neonatales Mausmodell verwendet, das die Untersuchung der einzigartigen Eigenschaften und der Biologie der Rückenmark-Neuronen in vitro ermöglicht .
Die Isolierung und Aufrechterhaltung von Neuronen in vitro ist nicht besonders einfach. Es gibt eine relative Häufigkeit von Techniken für die Neuronisolation aus dem kortikalen Gewebe von adulten Nagetieren, die in einer beträchtlichen Anzahl von isolierten Neuronen ( dh Millionen) 5 , 6 , 7. Im Gegensatz dazu ist die Ausbeute an Neuronen aus dem Rückenmarkgewebe geringer, 8 , 9 , 10 , zum Teil aufgrund der geringeren Gewebemasse. Darüber hinaus gibt es bei Mäusen eine relative Mangel an Techniken zur Isolierung von Neugeborenen Rückenmarksneuronen und bestehende Methoden sind durch niedrigere Neuronenausbeuten ( dh Hunderte) 9 oder mühsame und ressourcenschonende Techniken begrenzt, die die Isolierung von embryonalen Mäusen erfordern 10 .In diesem Protokoll, wirVerwenden Sie eine Technik, die die kosten- und ressourcenwirksame Isolierung einer beträchtlichen Anzahl von Neuronen aus den Rückenmarken von Neugeborenen ermöglicht. Wie es bei bisher veröffentlichten Techniken üblich ist, verwenden wir Papain als enzymatische Protease und erlauben die Freisetzung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe 5 , 6 . Darüber hinaus verwenden wir einen Dichtegradienten für die raffinierte Zelltrennung, der sich bisher als wirksam erwiesen hat 6 , 10 . Während das Medium, in dem die Zellen inkubiert werden, in unserer Erfahrung variieren kann und wie bereits veröffentlicht 11 , ergänzt sich die Ergänzung mit frischem B27-Kulturmedium-Supplement als kritisch für die Neuron-Langlebigkeit. Die Neuronen sind typischerweise für bis zu 10 Tage lebensfähig, so dass eine Behandlung durchgeführt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Technik ermöglicht die zuverlässige Kultur der Rückenmark Neuronen. Sobald die Technik erreicht ist, dauert es ca. 3,5 Stunden. Wir konnten die Isolierung von Neuronen aus 2 getrennten Würfen (16 Mäuse insgesamt) in ca. 4 h durchführen. Der entscheidende Schritt in der Machbarkeit ist es, die Rückenmarke von den Mäusen kompetent zu extrahieren. Die Ausbeute ermöglicht das Plattieren von mehreren Vertiefungen und die Fähigkeit, die Neuronen unter verschiedenen Bedingungen zu testen. Wir konnten die Neuron…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine Anerkennung.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
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