Здесь мы представляем поддерживаемый липидный бислой в контексте микрофлюидной платформы для изучения взаимодействия белок-фосфоинозитид с использованием метода без меток, основанного на модуляции рН.
Многочисленные клеточные белки взаимодействуют с поверхностями мембран, чтобы влиять на существенные клеточные процессы. Эти взаимодействия могут быть направлены на конкретный липидный компонент внутри мембраны, как в случае фосфоинозитидов (ПГИ), для обеспечения специфической субклеточной локализации и / или активации. PIPs и клеточные PIP-связывающие домены были широко изучены, чтобы лучше понять их роль в клеточной физиологии. Мы применили анализ модуляции рН на поддерживаемых липидных бислоях (SLB) в качестве инструмента для изучения взаимодействия белка с PIP. В этих исследованиях для определения белково-PIP-взаимодействий используется рН-чувствительный орто- сульфоподадим B-конъюгированный фосфатидилэтаноламин. При связывании белка с поверхностью, содержащей PIP-мембрану, межфазный потенциал модулируется ( т. Е. Изменяется локальный рН), изменяя состояние протонирования зонда. Пример успешного использования анализа модуляции рН представлен с использованием фосфолипазы C delta1 PleckstrВ гомологии (PLC-δ1 PH) и фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PI (4,5) P 2 ). Очевидная константа диссоциации ( K d, app ) для этого взаимодействия составляла 0,39 ± 0,05 мкМ, аналогично K d, значениям приложения, полученным другими. Как было отмечено ранее, ПЛК-δ1 домен РНА PI (4,5) P 2 специфический, показывает более слабое не связывание по отношению к фосфатидилинозитолам 4-фосфата, а не связывание с чистым фосфатидилхолином SLBS. Анализ PIP-на-чипе является преимуществом по сравнению с традиционными анализами связывания PIP, включая, но не ограничиваясь ими, низкий объем образца и отсутствие требований к маркировке лигандов / рецепторов, способность тестировать взаимодействия с высокой и низкой аффинностью мембран как с малыми, так и с малыми Больших молекул и улучшенного соотношения сигнал / шум. Соответственно, использование подхода PIP-на-чипе облегчит выяснение механизмов широкого спектра мембранных взаимодействий. Кроме того, этот метод потенциально может бытьSed при идентификации терапевтических средств, которые модулируют способность белка взаимодействовать с мембранами.
Мириады взаимодействий и биохимические процессы протекают на поверхности двумерных жидкостных мембран. Мембранные органеллы в эукариотических клетках уникальны не только в биохимических процессах и их ассоциированном протеоме, но также и в их составе липидов. Одним исключительным классом фосфолипидов является фосфоинозитиды (ПГИ). Несмотря на то, что они составляют лишь 1% клеточного липидома, они играют решающую роль в передаче сигналов, аутофагии и распространении мембран, среди прочих 1 , 2 , 3 , 4 . Динамическое фосфорилирование головной группы инозитола клеточными киназами PIP приводит к появлению семи головных групп PIP, моно-, бис- или трисфосфорилированных 5 . Кроме того, PIP определяют субклеточную идентичность мембран и служат специализированными местами для стыковки мембран для белков / ферментов, содержащих один или несколько фосфоиновНапример, гомологию Плекстрина (PH), гомологию Фокса (PX) и эпсиновую N-терминальную гомологию (ENTH) 6 , 7 . Одним из наиболее изученных PIP-связывающих доменов является домен фосфолипазы C (PLC) -δ1 PH, который специфически взаимодействует с 4,5-бисфосфатом фосфатидилинозитола (PI (4,5) P 2 ) в пределах сродства к высокому наномолярно-низкому микромолярному диапазону 8 , 9 , 10 , 11 .
Разработаны различные качественные и количественные методы in vitro и используются для изучения механизма, термодинамики и специфичности этих взаимодействий. Среди наиболее часто используемых анализов на PIP-связывание – поверхностный плазмонный резонанс (SPR), изотермическая калориметрия (ITC), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), липосомная флотация / седиментационный анализ и липид-блоты (Fat-blots / PIP-strip)12 , 13 . Несмотря на то, что они широко используются, все они имеют множество недостатков. Например, SPR, ITC и NMR требуют больших объемов выборки, дорогостоящих приборов и / или обученного персонала 12 , 13 . В некоторых форматах анализа, таких как липид-блоты на основе антител, используются водорастворимые формы ПГИ и представлены их нефизиологическим образом 12 , 14 , 15 , 16 . Кроме того, липидные пятна не могут быть надежно оценены количественно, и они часто приводили к ложным положительным / отрицательным наблюдениям 12 , 17 , 18 . Чтобы преодолеть эти проблемы и улучшить текущий набор инструментов, был создан новый метод без этикетки на основе поддерживаемого липидного бислоя (SLB) в контексте am icrofluidic платформы, который был успешно применен к изучению белок-ПУМ взаимодействий (Рисунок 1) 19.
Стратегия, используемая для обнаружения взаимодействий белок-PIP, основана на измерении модуляции pH. Это включает pH-чувствительный краситель, который имеет орто- сульфамодинамик B ( o SRB), непосредственно конъюгированный с группой 20 липидов липидов фосфатидилэтаноламина. Зонд o SRB-POPE ( рис. 2A ) сильно флуоресцентен при низком значении pH и гасит при высоком рН pKa около 6,7 в пределах 7,5 мол.% PI (4,5) P 2 -содержащих SLB ( рис. 5B ). PLC-δ1 домен PH широко используется для проверки методологий связывания белка с PIP из-за его высокой специфичности к PI (4,5) P 2 ( фиг.5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Мы полагали, что домен PLC-δ1 PH может быть использован для проверки его связывания с PI (4,5) P 2 с помощью анализа PIP-на-чипе. используемый в данном исследовании имеет суммарный положительный заряд (РI 8.4), и , следовательно , привлекает ОН -. ионы (рис 5с) После связывания с PI (4,5) P 2 отработанный SLBS, домен PH приносит ОН – ионов в Мембрана, которая, в свою очередь, модулирует межфазный потенциал и сдвигает состояние протонирования o SRB-POPE ( рис. 5C ) 26. В зависимости от концентрации домена PH флуоресценция гасится ( рис. 6A ). Наконец, нормированные данные Подходит для изотермы связывания для определения аффинности взаимодействия PH-домена-PI (4,5) P 2 ( рис. 6B , 6C ). </ Р>
В этом исследовании представлен подробный протокол для связывания белка с PIP-содержащими SLB в микрофлюидной платформе. Этот протокол позволяет читателю собирать микрожидкостное устройство и препарат везикул для образования SLB и связывания с белком. Кроме того, предоставляются направления для анализа данных для извлечения информации о сродстве для взаимодействия PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 .
Каждый вариант PIP, хотя и при низких концентрациях, присутствует на цитозольной поверхности конкретных органелл, где они способствуют установлению уникального физического состава и функциональной специфичности органелларной мембраны 1 . Одним из наиболее важных примене?…
The authors have nothing to disclose.
DS и CEC были частично поддержаны грантом AI053531 (NIAID, NIH); SS и PSC поддерживались грантом N00014-14-1-0792 (ONR).
Coverslip | |||
Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS | |||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device | |||
Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mold | |||
AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SUV | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Data Analysis | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | |||
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Altro | |||
Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |