Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.
Talrijke cellulaire eiwitten interageren met membraanoppervlakken om essentiële cellulaire processen te beïnvloeden. Deze interacties kunnen gericht zijn op een specifieke lipidcomponent binnen een membraan, zoals bij fosfoinositiden (PIP's), om specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie te waarborgen. PIP's en cellulaire PIP-bindende domeinen zijn uitgebreid bestudeerd om hun rol in cellulaire fysiologie beter te begrijpen. We hebben een pH-modulatie-analyse toegepast op ondersteunde lipid bilayers (SLB's) als middel om eiwit-PIP-interacties te bestuderen. In deze studies wordt pH-gevoelige ortho- sulforhodamine B geconjugeerde fosfatidylethanolamine gebruikt om eiwit-PIP-interacties te detecteren. Bij binding van een eiwit aan een PIP-bevattend membraanoppervlak wordt het grensvlakpotentiaal gemoduleerd ( dwz verandering in lokale pH), waarbij de protonatietoestand van de probe wordt verplaatst. Een casestudy van het succesvolle gebruik van de pH-modulatie-analyse wordt gepresenteerd door gebruik te maken van fosfolipase C delta1 Pleckstrin Homologie (PLC-δ1 PH) domein en fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) interactie voorbeeld. De schijnbare dissociatieconstante ( Kd , app ) voor deze interactie was 0,39 ± 0,05 μM, vergelijkbaar met Kd , appwaarden verkregen door anderen. Zoals eerder opgemerkt, de PLC-δ1 PH domein PI (4,5) P2 bepaald, toont zwakkere binding aan fosfatidylinositol-4-fosfaat en geen binding aan zuiver fosfatidylcholine SLBs. De PIP-op-een-chip-analyse is voordelig boven de traditionele PIP-bindingsassays, waaronder maar niet beperkt tot een laag monstervolume en geen eisen voor ligand / receptor-etikettering, het vermogen om membraaninteracties met hoge en lage affiniteit te testen met zowel kleine als Grote moleculen, en verbeterde signaal-ruisverhouding. Bijgevolg zal het gebruik van de PIP-on-a-chip-aanpak het verhelderen van mechanismen van een breed scala van membraaninteracties vergemakkelijken. Bovendien kan deze methode u mogelijk zijnSed in identificerende therapieën die het vermogen van eiwit om met membranen te interageren moduleren.
Myriade interacties en biochemische processen vinden plaats op tweedimensionale vloeistof membraanoppervlakken. Membraan-omsloten organellen in eukaryote cellen zijn uniek, niet alleen in biochemische processen en hun bijbehorende proteome maar ook in hun lipidsamenstelling. Een uitzonderlijke klasse fosfolipiden is fosfoinositiden (PIP's). Hoewel ze slechts 1% van het cellulair lipidoom omvatten, spelen ze een cruciale rol in signaaltransductie, autofagie en membraanhandel, onder andere 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamische fosforylering van de inositol-hoofdgroep door cellulaire PIP-kinasen leidt tot zeven PIP-hoofdgroepen die mono-, bis- of trisfosforyleerd zijn 5 . Bovendien definiëren PIP's de subcellulaire identiteit van membranen en dienen als gespecialiseerde membraan docking sites voor proteïnen / enzymen die één of meer fosfoïnen bevattenBindende domeinen, bijvoorbeeld Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) en epsin N-terminale Homology (ENTH) 6 , 7 . Een van de best bestudeerde PIP-bindende domeinen is fosfolipase C (PLC) -δ1 PH domein dat specifiek interageert met fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) bij een hoge nanomolaire laag micromolaire gebied affiniteit 8 , 9 , 10 , 11 .
Er zijn verschillende kwalitatieve en kwantitatieve in vitro methoden ontwikkeld en gebruikt om het mechanisme, de thermodynamica en de specificiteit van deze interacties te bestuderen. Onder de meest gebruikelijke PIP-bindende assays zijn oppervlakte plasmon resonantie (SPR), isothermale calorimetrie (ITC), NMR-spectroscopie, liposome flotatie / sedimentatie assay en lipide-blots (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Alhoewel deze uitgebreid worden gebruikt, hebben ze allemaal veel nadelen. Bijvoorbeeld, SPR, ITC en NMR vereisen grote hoeveelheden monster, dure instrumentatie en / of getraind personeel 12 , 13 . Enkele assayformaten zoals antilichamen gebaseerde lipide-blots gebruiken wateroplosbare vormen van PIP's en presenteren ze op een nonfysiologische wijze 12 , 14 , 15 , 16 . Bovendien kunnen lipide-blots niet betrouwbaar worden gekwantificeerd en hebben ze vaak geleid tot valse positieve / negatieve waarnemingen 12 , 17 , 18 . Om deze uitdagingen te overwinnen en te verbeteren op de huidige gereedschapsset werd een nieuwe labelvrije methode op basis van een ondersteunde lipid bilayer (SLB) opgesteld in het kader van am Microfluidisch platform, dat succesvol werd toegepast op de studie van eiwit-PIP-interacties ( Figuur 1 ) 19 .
De strategie die wordt gebruikt voor het detecteren van eiwit-PIP-interacties is gebaseerd op pH-modulatie detectie. Dit omvat een pH-gevoelige kleurstof die ortho- sulforhodamine B ( o SRB) direct geconjugeerd is met fosfatidylethanolamine lipide hoofdgroep 20 . O SRB-POPE probe (Figuur 2A) is sterk fluorescerende bij lage pH en geblust bij hoge pH met een pKa ongeveer 6,7 bij 7,5 mol% PI (4,5) P2 bevattende SLBs (Figuur 5B). PLC-δ1 PH domein is uitgebreid gebruikt voor het valideren eiwit-PIP-bindende methoden vanwege de hoge specificiteit voor PI (4,5) P2 (figuur 5A) 21, 22,"> 23, 24, 25 .Hence, redeneerden we dat de PLC-δ1 PH-domein kan worden gebruikt om te testen de binding aan PI (4,5) P2 via het PIP-on-a-chip assay. Het PH-gebied construct in deze studie gebruikte een netto positieve lading (pi 8,4), en daardoor aantrekt OH -. ionen (figuur 5C) bij binding aan PI (4,5) P2 bevattende SLBs, het PH domein brengt de OH – ionen aan de Membraanoppervlak, dat op zijn beurt het grensvlakpotentiaal moduleert en de protonatietoestand van o SRB-POPE ( Figuur 5C ) 26 verplaatst. Als een functie van de PH-domeinconcentratie wordt de fluorescentie uitgeblust ( Figuur 6A ). Ten slotte zijn de genormaliseerde gegevens passen bij een bindingsisotherm om de affiniteit van het PH-domein-PI (4,5) P2 interactie (Figuur 6B, 6C). bepalen </ P>
In deze studie wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om eiwitbinding uit te voeren naar PIP-bevattende SLB's in een microfluïdisch platform. Dit protocol neemt de lezer van het samenstellen van het microfluïdische apparaat en de vesikelpreparatie op SLB-vorming en eiwitbinding. Bovendien aanwijzingen voor gegevensanalyse affiniteitinformatie voor PLC-δ1 PH domein-PI (4,5) P2 interactie verschaft extraheren.
Elke PIP variant, zij het bij lage concentraties, is aanwezig op het cytosolische oppervlak van specifieke organellen, waar zij bijdragen aan de totstandbrenging van een unieke fysieke samenstelling en functionele specificiteit van het organellair membraan 1 . Een van de belangrijkste toepassingen van PIP's is als een specifiek docking platform voor de veelheid van eiwitten die specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie 6 , 7</s…
The authors have nothing to disclose.
DS en CEC werden gedeeltelijk ondersteund door subsidie AI053531 (NIAID, NIH); SS en PSC werden ondersteund door subsidie N00014-14-1-0792 (ONR).
Coverslip | |||
Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS | |||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device | |||
Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mold | |||
AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SUV | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Data Analysis | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | |||
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Altro | |||
Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |