כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.
חלבונים תאיים רבים אינטראקציה עם משטחי קרום להשפיע על תהליכים תאיים חיוניים. אינטראקציות אלו יכולות להיות מכוונות כלפי רכיב שומנים מסוים בתוך קרום, כמו במקרה של phosphoinositides (PIPs), כדי להבטיח לוקליזציה תת-תאית ספציפית ו / או הפעלה. PIPs ותחומים PIP מחייב הסלולר נחקרו בהרחבה כדי להבין טוב יותר את תפקידם פיזיולוגיה הסלולר. אנו להחיל assay pH אפנון על bilayers השומנים הנתמכים (SLBs) ככלי ללמוד אינטראקציות חלבון PIP. במחקרים אלה, phosphatidylethanolamine אורתו רגיש pH -Sulforhodamine B מצומדות משמש לזיהוי אינטראקציות חלבון-PIP. על מחייב של חלבון על משטח קרום המכיל PIP, פוטנציאל interfacial מאופנן ( כלומר שינוי pH המקומי), הזזת מצב פרוטוניון של בדיקה. מחקר מקרה של שימוש מוצלח של assay אפנון pH מוצג באמצעות phospholipase C delta1 Pleckstrב Homology (PLC-δ1 PH) תחום ו phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) אינטראקציה כדוגמה. קבועה דיסוציאציה לכאורה ( K ד, App ) עבור אינטראקציה זו היה 0.39 ± 0.05 מיקרומטר, בדומה K , ד ערכים שהושגו על ידי אחרים. כפי שנצפה בעבר, תחום PLC-δ1 PH הוא PI (4,5) P 2 ספציפי, מראה מחייב חלש יותר כלפי phosphatidylinositol 4-phosphate, ולא מחייב טהור phosphatidylcholine SLBs. ה- PIP על שבב assay הוא יתרון על פני מבחני PIP מחייב המסורתית, כולל אך לא מוגבל נפח מדגם נמוך ולא ליגנד / קולטן תיוג דרישות, היכולת לבדוק אינטראקציות קרום גבוה זיקה נמוכה זיקה עם קטן ו מולקולות גדולות, ושיפור האות לרעש יחס. לפיכך, השימוש בגישה PIP-on-a-chip יאפשר הבהרה של מנגנונים של מגוון רחב של אינטראקציות קרום. יתר על כן, שיטה זו עלולה להיות uSed בזיהוי תרפויטים המווסתים את יכולתו של החלבון לקיים אינטראקציה עם ממברנות.
אינטראקציות מרובות תהליכים ביוכימיים מתרחשים על משטחים נוזל מימדי דו מימדי. אורגניזמים בממברנה בתאים אאוקריוטים ייחודיים לא רק בתהליכים ביוכימיים ובפרוטאומה הקשורה אליהם, אלא גם בהרכב השומנים שלהם. מחלקה יוצאת דופן אחת של phospholipids היא phosphoinositides (PIPs). למרות שהם מהווים רק 1% של lipidome הסלולר, הם ממלאים תפקיד מכריע transduction האות, autophagy, וסחר קרום, בין היתר 1 , 2 , 3 , 4 . זרחון דינמי של קבוצת הראש inositol על ידי קינאזות PIP הסלולר מעורר שבעה קבוצות ראשיות PIP כי הם מונו, bis, או tris-phosphorylated 5 . בנוסף, PIPs מגדירים את הזהות התת-תאית של הממברנות ומשמשים כאתרי עגינה מיוחדים לממברנות / אנזימים המכילים פוספוינוס אחד או יותרתחומים מחייב, למשל, Pleckstrin הומולוגיה (PH), Phox הומולוגיה (PX), epsin N- מסוף הומולוגיה (ENTH) 6 , 7 . אחד התחומים הנחקרים ביותר PIP מחייב הוא phospholipase C (PLC) -δ1 PH תחום זה באופן ספציפי אינטראקציה עם phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) בתוך טווח גבוה nromomolar נמוך מיקרומטר טווח זיקה 8 , 9 , 10 , 11 .
מגוון של שיטות איכותיות וכמותיות במבחנה פותחו והשתמשו כדי ללמוד את המנגנון, התרמודינמיקה, ואת הספציפיות של אינטראקציות אלה. בין מבחני ה- PIP המחוברים הנפוצים ביותר הם תהודה של פלסמון על פני השטח (SPR), קלורימטרי איזותרמי (ITC), ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), הצפת ליפוזום / אסאי משקעים, כתמי שומנים (כתמי שומן / רצועות PIP)12 , 13 . למרות אלו הם בשימוש נרחב, לכולם יש חסרונות רבים. לדוגמה, SPR, ITC ו- NMR דורשים כמויות גדולות של מדגם, מכשור יקר ו / או כוח אדם מיומן 12 , 13 . כמה פורמטים assay כגון נוגדנים מבוססי ליפידים כתמים לנצל מים מסיסים צורות של PIPs ולהציג אותם בצורה לא פיזיולוגיים 12 , 14 , 15 , 16 . בנוסף, כתמי שומנים לא ניתן לכמת באופן מהימן והם הביאו לעתים קרובות תצפיות כוזבות / שליליות כוזבות 12 , 17 , 18 . כדי להתגבר על אתגרים אלה ולשפר על הכלי הנוכחי להגדיר, שיטה חדשה ללא תווית הוקם מבוסס על השומנים נתמך bilayer (SLB) בהקשר של am פלטפורמה icrofluidic, אשר הוחל בהצלחה במחקר של אינטראקציות חלבון PIP ( איור 1 ) 19 .
האסטרטגיה המשמשת לגילוי אינטראקציות חלבון PIP מבוססת על חישה אפנון pH. זה כרוך צבע רגיש-pH כי יש B Ortho -Sulforhodamine (o SRB) מצומד ישירות לקבוצת ראש השומנים phosphatidylethanolamine 20. O SRB-POPE בדיקה ( איור 2 א ) הוא פלואורסצנטי מאוד ב pH נמוך ו הרווה ב pH גבוה עם pKa סביב 6.7 בתוך 7.5% מול PI (4,5) P 2 המכיל SLBs ( איור 5 ב ). תחום ה- PLC-δ1 PH נעשה בהרחבה לאימות מתודולוגיות של חלבונים-PIP, בשל הייחודיות הגבוהה שלו כלפי PI (4,5) P 2 ( איור 5 א ' ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25 .לפיכך, הנחנו כי תחום ה- PLC-δ1 PH יכול לשמש לבדיקת המחיצה ל- PI (4,5) P 2 דרך ה- PIP-on-a-chip. השתמשו במחקר זה יש מטען חיובי נטו (PI 8.4), ובכך מושך OH -. יונים (איור 5 ג) עם קשירה PI (4,5) P 2 SLBs המכילים, תחום PH מביא את OH – יונים אל משטח הממברנה, אשר בתורו מודולציה פוטנציאל interfacial משמרות מדינת protonation של o SRB-האפיפיור (איור 5 ג) 26. כפועל יוצא של ריכוז תחום PH, הקרינה הוא רווה (איור 6 א). לבסוף, הנתונים המנורמלים הוא כדי להתאים את הזיקה של PH-PI (4,5) P 2 אינטראקציה ( איור 6 ב , 6 ג ). </ P>
במחקר זה, פרוטוקול מפורט מסופק לבצע חלבון מחייב PIP המכילים SLBs בתוך פלטפורמה microfluidic. פרוטוקול זה לוקח את הקורא מ הרכבה את המכשיר microfluidic הכנה שלפוחית כדי היווצרות SLB וחלבון מחייב. בנוסף, ניתנים הוראות לניתוח נתונים כדי לחלץ מידע זיקה עבור האינטראקציה PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 .
כל חלופה PIP, אם כי בריכוזים נמוכים, נמצא על פני השטח cytosolic של האברונים ספציפיים שבו הם תורמים להקמת הרכב פיזי ייחודי סגוליות תפקודית של קרום organellar 1 . אחד השימושים החשובים ביותר של PIPs הוא כמו פלטפורמת עגינה ספציפית עבור שפע של חלבונים המחייבים לוקליזציה subce…
The authors have nothing to disclose.
DS ו CEC נתמכו, בין היתר, על ידי מתן AI053531 (NIAID, NIH); SS ו- PSC נתמכו על ידי מענק N00014-14-1-0792 (ONR).
Coverslip | |||
Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS | |||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device | |||
Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mold | |||
AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SUV | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Data Analysis | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | |||
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Altro | |||
Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |