Her presenterer vi et støttet lipid-dobbeltlag i sammenheng med en mikrofluidisk plattform for å studere protein-fosfonositid-interaksjoner ved bruk av en etikettfri metode basert på pH-modulering.
Mange cellulære proteiner interagerer med membranoverflater for å påvirke viktige cellulære prosesser. Disse interaksjonene kan rettes mot en bestemt lipidkomponent i en membran, som i tilfelle fosforinositider (PIP), for å sikre spesifikk subcellulær lokalisering og / eller aktivering. PIP og cellulære PIP-bindende domener har blitt studert omfattende for å bedre forstå deres rolle i cellulær fysiologi. Vi brukte en pH-modulasjonsanalyse på støttede lipid-bilayers (SLB) som et verktøy for å studere protein-PIP-interaksjoner. I disse studiene brukes pH-følsom orto- Sulforhodamine B-konjugert fosfatidyletanolamin til å oppdage protein-PIP-interaksjoner. Ved binding av et protein til en PIP-holdig membranoverflate, blir grensepotensialet modulert ( dvs. forandring i lokal pH), skiftende protonasjonstilstanden til proben. En case-studie av den vellykkede bruken av pH-modulasjonsanalysen presenteres ved bruk av fosfolipase C delta1 Pleckstri Homologi (PLC-δ1 PH) domene og fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P-2) vekselvirkning som et eksempel. Den tilsynelatende dissosiasjonskonstanten ( K d, app ) for denne interaksjonen var 0,39 ± 0,05 uM, lik Kd, app- verdier oppnådd av andre. Som tidligere observert, PLC-δ1 PH domene er PI (4,5) P2 bestemt, viser svakere binding til fosfatidylinositol-4-fosfat, og ingen binding til rene fosfatidylcholin SLBs. PIP-on-a-chip-analysen er fordelaktig i forhold til tradisjonelle PIP-bindingsanalyser, inkludert men ikke begrenset til lavt prøvevolum og ingen krav til ligand / reseptormerking, evnen til å teste høy- og lavaffinitetsmembran-interaksjoner med både små og Store molekyler, og forbedret signal til støyforhold. Følgelig vil bruken av PIP-on-a-chip-tilnærmingen lette oppklaringen av mekanismer med et bredt spekter av membraninteraksjoner. Videre kan denne metoden potensielt være degSed i identifiserende terapi som modulerer proteinets evne til å interagere med membraner.
Myriade interaksjoner og biokjemiske prosesser finner sted på todimensjonalt flytende membranoverflater. Membran-lukkede organeller i eukaryote celler er unike, ikke bare i biokjemiske prosesser og deres tilhørende proteom, men også i deres lipidsammensetning. En eksepsjonell klasse fosfolipider er fosfinositider (PIP). Selv om de bare utgjør 1% av det cellulære lipidomet, spiller de en avgjørende rolle i signaltransduksjon, autofag og membranhandel, blant annet 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamisk fosforylering av inositolhovedgruppen med cellulære PIP-kinaser gir opphav til syv PIP-hodegrupper som er mono-, bis- eller tris-fosforylerte 5 . I tillegg definerer PIP den subcellulære identiteten til membraner og tjener som spesialiserte membrandokkingssteder for proteiner / enzymer som inneholder en eller flere fosforinosyrerItid-bindende domener, for eksempel Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) og epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . En av de mest studerte PIP-bindende domener er fosfolipase C (PLC) -δ1 PH domene som spesifikt interagerer med fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P-2) innen et høy-nanomolar lavt mikromolområde affinitet 8 , 9 , 10 , 11 .
En rekke kvalitative og kvantitative in vitro- metoder har blitt utviklet og brukt til å studere mekanismen, termodynamikken og spesifisiteten av disse interaksjonene. Blant de mest brukte PIP-bindingsanalysene er overflateplasmonresonans (SPR), isotermisk kalorimetri (ITC), atommagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, liposomflotasjon / sedimenteringsanalyse og lipidblots (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Selv om disse er mye brukt, har de alle mange ulemper. For eksempel krever SPR, ITC og NMR store mengder prøve, dyr instrumentering og / eller trent personell 12 , 13 . Noen analysemetoder som antistoffbaserte lipidblottene benytter vannløselige former av PIP og presenterer dem på en ikke-fysiologisk måte 12 , 14 , 15 , 16 . I tillegg kan lipidblots ikke kvantifiseres pålitelig, og de har ofte resultert i falske positive / negative observasjoner 12 , 17 , 18 . For å overvinne disse utfordringene og forbedre det nåværende verktøysettet ble det etablert en ny etikettfri metode basert på et støttet lipid-dobbeltlag (SLB) i sammenheng med am Mikrofluidisk plattform, som ble brukt til studier av protein-PIP-interaksjoner ( figur 1 ) 19 .
Strategien som brukes til å oppdage protein-PIP-interaksjoner, er basert på pH-moduleringsavkjenning. Dette innebærer et pH-følsomt fargestoff som har orto- sulforhodamin B ( o SRB) direkte konjugert til fosfatidyletanolamin lipid hode gruppe 20 . O SRB-POPE sonde (figur 2A) er meget fluorescerende ved lav pH, og reaksjonen stoppet ved høy pH med en pKa-verdi omkring 6,7 i løpet av 7,5 mol% PI (4,5) P-2 -holdige SLBs (figur 5B). PLC-δ1 PH domene har blitt brukt i stor utstrekning for å validere protein-PIP-bindende metoder på grunn av sin høye spesifisitet overfor PI (4,5) P2 (figur 5A) 21, 22,"> 23 , 24 , 25. Derfor redegjorde vi for at PLC-δ1 PH-domenet kan brukes til å teste dets binding til PI (4,5) P 2 gjennom PIP-on-a-chip-analysen. anvendt i denne studien har en netto positiv ladning (pl 8,4), og derved tiltrekker OH -. ioner (figur 5c) Ved binding til PI (4,5) P 2 -inneholdende SLBs, PH domene bringer de OH – ioner til membranoverflaten, hvilket i sin tur modulerer grenseflatepotensialet og forskyver protonering tilstand av o SRB-POPE (figur 5C) 26. som en funksjon av pH-domenet konsentrasjon blir fluorescens stanset (figur 6A). til slutt, er den normaliserte data passer til et bindende isotermen for å bestemme affiniteten av PH domene-PI (4,5) P2 interaksjon (figur 6B, 6C). '/ P>
I denne studien er det gitt en detaljert protokoll for å utføre proteinbinding til PIP-holdige SLB i en mikrofluidisk plattform. Denne protokollen tar leseren fra å samle den mikrofluidiske enheten og vesikelpreparatet til SLB-dannelse og proteinbinding. I tillegg til retninger for dataanalyse trekke ut informasjon affinitet for PLC-δ1 PH domene-PI (4,5) P2 interaksjon er gitt.
Hver PIP-variant, om enn i lave konsentrasjoner, er tilstede på den cytosoliske overflaten av spesifikke organeller hvor de bidrar til etableringen av en unik fysisk sammensetning og funksjonell spesifisitet av organellarmembranen 1 . En av de viktigste bruksområdene til PIP er som en spesifikk dockingsplattform for mangfoldet av proteiner som krever spesifikk subcellulær lokalisering og / eller aktivering 6 , 7 . På grunn av sin roll…
The authors have nothing to disclose.
DS og CEC ble støttet, delvis, ved tildeling AI053531 (NIAID, NIH); SS og PSC ble støttet av stipend N00014-14-1-0792 (ONR).
Coverslip | |||
Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS | |||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device | |||
Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mold | |||
AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SUV | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Data Analysis | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | |||
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Altro | |||
Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |