JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Bioingegneria

PIP-on-a-chip: En etikettfri studie av protein-fosfinositid-interaksjoner

Published: July 27, 2017
doi:
10.3791/55869
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry,The Pennsylvania State University

Summary

Her presenterer vi et støttet lipid-dobbeltlag i sammenheng med en mikrofluidisk plattform for å studere protein-fosfonositid-interaksjoner ved bruk av en etikettfri metode basert på pH-modulering.

Abstract

Mange cellulære proteiner interagerer med membranoverflater for å påvirke viktige cellulære prosesser. Disse interaksjonene kan rettes mot en bestemt lipidkomponent i en membran, som i tilfelle fosforinositider (PIP), for å sikre spesifikk subcellulær lokalisering og / eller aktivering. PIP og cellulære PIP-bindende domener har blitt studert omfattende for å bedre forstå deres rolle i cellulær fysiologi. Vi brukte en pH-modulasjonsanalyse på støttede lipid-bilayers (SLB) som et verktøy for å studere protein-PIP-interaksjoner. I disse studiene brukes pH-følsom orto- Sulforhodamine B-konjugert fosfatidyletanolamin til å oppdage protein-PIP-interaksjoner. Ved binding av et protein til en PIP-holdig membranoverflate, blir grensepotensialet modulert ( dvs. forandring i lokal pH), skiftende protonasjonstilstanden til proben. En case-studie av den vellykkede bruken av pH-modulasjonsanalysen presenteres ved bruk av fosfolipase C delta1 Pleckstri Homologi (PLC-δ1 PH) domene og fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P-2) vekselvirkning som et eksempel. Den tilsynelatende dissosiasjonskonstanten ( K d, app ) for denne interaksjonen var 0,39 ± 0,05 uM, lik Kd, app- verdier oppnådd av andre. Som tidligere observert, PLC-δ1 PH domene er PI (4,5) P2 bestemt, viser svakere binding til fosfatidylinositol-4-fosfat, og ingen binding til rene fosfatidylcholin SLBs. PIP-on-a-chip-analysen er fordelaktig i forhold til tradisjonelle PIP-bindingsanalyser, inkludert men ikke begrenset til lavt prøvevolum og ingen krav til ligand / reseptormerking, evnen til å teste høy- og lavaffinitetsmembran-interaksjoner med både små og Store molekyler, og forbedret signal til støyforhold. Følgelig vil bruken av PIP-on-a-chip-tilnærmingen lette oppklaringen av mekanismer med et bredt spekter av membraninteraksjoner. Videre kan denne metoden potensielt være degSed i identifiserende terapi som modulerer proteinets evne til å interagere med membraner.

Introduction

Myriade interaksjoner og biokjemiske prosesser finner sted på todimensjonalt flytende membranoverflater. Membran-lukkede organeller i eukaryote celler er unike, ikke bare i biokjemiske prosesser og deres tilhørende proteom, men også i deres lipidsammensetning. En eksepsjonell klasse fosfolipider er fosfinositider (PIP). Selv om de bare utgjør 1% av det cellulære lipidomet, spiller de en avgjørende rolle i signaltransduksjon, autofag og membranhandel, blant annet 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamisk fosforylering av inositolhovedgruppen med cellulære PIP-kinaser gir opphav til syv PIP-hodegrupper som er mono-, bis- eller tris-fosforylerte 5 . I tillegg definerer PIP den subcellulære identiteten til membraner og tjener som spesialiserte membrandokkingssteder for proteiner / enzymer som inneholder en eller flere fosforinosyrerItid-bindende domener, for eksempel Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) og epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . En av de mest studerte PIP-bindende domener er fosfolipase C (PLC) -δ1 PH domene som spesifikt interagerer med fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P-2) innen et høy-nanomolar lavt mikromolområde affinitet 8 , 9 , 10 , 11 .

En rekke kvalitative og kvantitative in vitro- metoder har blitt utviklet og brukt til å studere mekanismen, termodynamikken og spesifisiteten av disse interaksjonene. Blant de mest brukte PIP-bindingsanalysene er overflateplasmonresonans (SPR), isotermisk kalorimetri (ITC), atommagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, liposomflotasjon / sedimenteringsanalyse og lipidblots (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Selv om disse er mye brukt, har de alle mange ulemper. For eksempel krever SPR, ITC og NMR store mengder prøve, dyr instrumentering og / eller trent personell 12 , 13 . Noen analysemetoder som antistoffbaserte lipidblottene benytter vannløselige former av PIP og presenterer dem på en ikke-fysiologisk måte 12 , 14 , 15 , 16 . I tillegg kan lipidblots ikke kvantifiseres pålitelig, og de har ofte resultert i falske positive / negative observasjoner 12 , 17 , 18 . For å overvinne disse utfordringene og forbedre det nåværende verktøysettet ble det etablert en ny etikettfri metode basert på et støttet lipid-dobbeltlag (SLB) i sammenheng med am Mikrofluidisk plattform, som ble brukt til studier av protein-PIP-interaksjoner ( figur 1 ) 19 .

Strategien som brukes til å oppdage protein-PIP-interaksjoner, er basert på pH-moduleringsavkjenning. Dette innebærer et pH-følsomt fargestoff som har orto- sulforhodamin B ( o SRB) direkte konjugert til fosfatidyletanolamin lipid hode gruppe 20 . O SRB-POPE sonde (figur 2A) er meget fluorescerende ved lav pH, og reaksjonen stoppet ved høy pH med en pKa-verdi omkring 6,7 i løpet av 7,5 mol% PI (4,5) P-2 -holdige SLBs (figur 5B). PLC-δ1 PH domene har blitt brukt i stor utstrekning for å validere protein-PIP-bindende metoder på grunn av sin høye spesifisitet overfor PI (4,5) P2 (figur 5A) 21, 22,"> 23 , 24 , 25. Derfor redegjorde vi for at PLC-δ1 PH-domenet kan brukes til å teste dets binding til PI (4,5) P 2 gjennom PIP-on-a-chip-analysen. anvendt i denne studien har en netto positiv ladning (pl 8,4), og derved tiltrekker OH -. ioner (figur 5c) Ved binding til PI (4,5) P 2 -inneholdende SLBs, PH domene bringer de OH – ioner til membranoverflaten, hvilket i sin tur modulerer grenseflatepotensialet og forskyver protonering tilstand av o SRB-POPE (figur 5C) 26. som en funksjon av pH-domenet konsentrasjon blir fluorescens stanset (figur 6A). til slutt, er den normaliserte data passer til et bindende isotermen for å bestemme affiniteten av PH domene-PI (4,5) P2 interaksjon (figur 6B, 6C). '/ P>

I denne studien er det gitt en detaljert protokoll for å utføre proteinbinding til PIP-holdige SLB i en mikrofluidisk plattform. Denne protokollen tar leseren fra å samle den mikrofluidiske enheten og vesikelpreparatet til SLB-dannelse og proteinbinding. I tillegg til retninger for dataanalyse trekke ut informasjon affinitet for PLC-δ1 PH domene-PI (4,5) P2 interaksjon er gitt.

Protocol

1. Rengjøring av glassdeksler Fortynn 7x Rengjøringsløsning (se Materialebord ) 7 ganger med deionisert vann i en 100 mm dyp borosilikat glassfat med en flat bunn og varm den opp til 95 ° C på en varmepanne i 20 minutter eller til den overskyede løsningen blir klar . MERK: Løsningen blir varm, vær forsiktig for å unngå kroppsskader. 7x-rengjøringsløsningen er en proprietær blanding av heksasodium [oksydo- [oksido (fosfonatooksy) fosforyl] oksyfosforyl] fosfat, 2- (2-butoks…

Representative Results

Vi brukte pH modulasjon assay for å studere PLC-δ1 PH domene-PI (4,5) P2 vekselvirkning innenfor et PIP-på-en-brikke microdevice (figur 1). Gjennom en detaljert protokoll demonstrerte vi hvordan du klargjør og monterer mikrofluidiske komponenter, lager små unilamellære vesikler (SUVer) ( figur 2 ), danner SLBer i en enhet ( Figur 3 ) og testet proteinbinding til PIP-holdige SLB. Et …

Discussion

Hver PIP-variant, om enn i lave konsentrasjoner, er tilstede på den cytosoliske overflaten av spesifikke organeller hvor de bidrar til etableringen av en unik fysisk sammensetning og funksjonell spesifisitet av organellarmembranen 1 . En av de viktigste bruksområdene til PIP er som en spesifikk dockingsplattform for mangfoldet av proteiner som krever spesifikk subcellulær lokalisering og / eller aktivering 6 , 7 . På grunn av sin roll…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DS og CEC ble støttet, delvis, ved tildeling AI053531 (NIAID, NIH); SS og PSC ble støttet av stipend N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate  Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Altro
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochimica. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O’Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what’s in it for biomedical applications?. Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochimica. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

Tags

Protein-phosphoinositide InteractionsLabel-freeMembrane InteractionsPIP-on-a-chip AssayPDMSPhosphatidylcholinePhosphatidylinositol 45-bisphosphatePH-sensitive Fluorescent ProbeLipid VesiclesLabel-free MonitoringBiologically RelevantTherapeutic TargetsMembrane Proteins

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image