Inducción y diagnóstico de tumores en<em> Drosophila</em> Imaginal Disc Epitelio
Summary
El análisis de clones mosaicos en el epitelio discal imaginario de Drosophila es un poderoso sistema modelo para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. Aquí se describe un protocolo para inducir tumores en Drosophila ala imaginal discos utilizando el sistema GAL4-UAS, e introducir un método de diagnóstico para clasificar los tumores fenotipos.
Abstract
En las primeras etapas del cáncer, las células mutantes transformadas muestran anormalidades citológicas, comienzan un crecimiento excesivo no controlado y alteran progresivamente la organización tisular. Drosophila melanogaster ha surgido como un modelo experimental popular en el sistema de biología del cáncer para estudiar los mecanismos genéticos y celulares de la tumorigénesis. En particular, las herramientas genéticas para los discos imaginarios de Drosophila (desarrollo de epitelios en larvas) permiten la creación de células pro tumorales transformadas dentro de un tejido epitelial normal, situación similar a las etapas iniciales del cáncer humano. Sin embargo, un estudio reciente de tumorigénesis en discos imaginarios de alas de Drosophila demostró que la iniciación tumoral depende de la citoarquitectura intrínseca del tejido y del microambiente local, lo que sugiere que es importante considerar la susceptibilidad específica de la región a los estímulos tumorigénicos en la evaluación de fenotipos tumorales en imaginal Discos Para facilitar el análisis fenotípico del progreso tumoralEn discos imaginal, aquí se describe un protocolo para experimentos genéticos utilizando el sistema GAL4-UAS para inducir tumores neoplásicos en discos imaginal de ala. Además, hemos introducido un método de diagnóstico para clasificar los fenotipos de las lesiones clonales inducidas en el epitelio imaginal, como un método de clasificación clara para discriminar las diversas etapas de la progresión tumoral (como la hiperplasia, displasia o neoplasia) no se había descrito anteriormente. Estos métodos podrían aplicarse ampliamente al análisis clonal de fenotipos tumorales en diversos órganos de Drosophila .
Introduction
Los tejidos epiteliales son sistemas altamente organizados que tienen la notable capacidad homeostática de mantener su organización a través del desarrollo y la renovación celular. Este robusto sistema de auto-organización, sin embargo, se interrumpe progresivamente durante el desarrollo del tumor. Al comienzo del desarrollo del tumor, las células mutantes individuales que surgen de la activación del oncogén o la inactivación del gen supresor del tumor emergen dentro de una capa epitelial. Cuando esta transformada "célula pro-tumor" evade un ambiente supresor, interrumpe la organización epitelial, y comienza la proliferación incontrolada, la tumorigénesis se produce 1 . Durante las últimas décadas, avances tecnológicos sobresalientes en genética y biología molecular han hecho progresos notables en la investigación del cáncer. En particular, los estudios recientes que utilizan los instrumentos de análisis genéticamente mosaico en Drosophila melanogaster , tales como la recombinación mitótica FLP-FRT (recombinante flippase / flase recombinase)ación 2 y flip-out-GAL4-UAS sistemas (secuencia de activación aguas arriba) 3, han contribuido enormemente a una mejor comprensión de los mecanismos genéticos implicados en la formación y metástasis de tumores 4, 5, 6.
Los estudios de un grupo de genes supresores de tumores conservados de Drosophila , larvas gigantes letales ( lgl ), discos grandes ( dlg ) y garabatos ( scrib ), resaltaron la relación crítica entre la pérdida de organización epitelial y el desarrollo tumoral, ya que estos genes desempeñan papeles clave En la regulación de la polaridad celular apical-basal y la proliferación celular en los tejidos epiteliales [ 7] . Mientras que los discos imaginarios de Drosophila son normalmente epitelios monocapa, las mutaciones homocigóticas en cualquiera de estos tres genes hacen que las células pierdan estructura y polaridad, no difierenRentizar, sobreproliferar y, finalmente, formar masas amorfas multicapa que se funden con tejidos adyacentes 7 . Del mismo modo, la interrupción de estos genes en los mamíferos está involucrado en el desarrollo de tumores malignos [ 8 , 9] . Los fenotipos neoplásicos exhibidos por los tejidos mutantes han llevado a la clasificación de estos tres genes conservados, genes neoplásicos supresores de tumores (nTSGs) [ 7 , 8] . Sin embargo, cuando homozygous nTSG células mutantes son esporádicos generados en el desarrollo de tipo salvaje discursos imaginales utilizando FLP-FRT mediada por la recombinación mitótica, las células mutantes son eliminados del tejido a través de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) -dependiente apoptosis 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusión 15 </suP> , 16 , o el engolfamiento y la fagocitosis por los vecinos [ 17] . En este epitelio genéticamente mosaico, la apoptosis se detecta principalmente en las células mutantes nTSG localizadas en el límite del clon, lo que sugiere que las células normales adyacentes desencadenar la apoptosis de nTSG células mutantes [ 10 , 11 , 12 , 18] . Estudios recientes en células de mamíferos han confirmado que esta eliminación celular dependiente de la competencia de las células pro-tumor es un mecanismo evolutivo conservado epiteliales de autodefensa contra el cáncer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Un reciente estudio en Drosophila imaginal discos, sin embargo, mostró que mosaico nTSG-knockdown clones induce tumores neoplásicos en especificaIc de los discos imaginal de ala 16 . La formación inicial de tumores se encontró siempre en la región periférica de la "bisagra" y nunca se observó en la región central de la "bolsa" del epitelio del disco de ala, lo que sugiere que el potencial tumorigénico de las células knockdown nTSG depende del entorno local. La región de la bolsa central funciona como una "mancha fría del tumor" donde las células pro-tumor no muestran sobrecrecimiento displásico, mientras que la región bisagra periférica se comporta como un "hotspot tumoral" 16 . En las regiones de bolsa "coldspot", las células de desmontaje de nTSG se deslaminan desde el lado basal y sufren apoptosis. Por el contrario, como "hotspot" bisagra células poseen una red de estructuras robusto citoesqueleto en sus lados basales, nTSG-knockdown células delaminate desde el lado apical del epitelio e iniciar tumorigenic sobrecrecimiento [ 16] . Por lo tanto, el análisis de los fenotipos tumorales en discos imaginal requiereLa susceptibilidad específica de la región a estímulos tumorigénicos.
En este sentido, se describe un protocolo para inducir la formación de tumores neoplásicos en el disco Drosophila imaginal discos utilizando el GAL4-UAS- RNAi sistema por el cual nTSG-knockdown células se generan en el epitelio del disco de ala normal. Aunque estos sistemas experimentales son útiles para estudiar las primeras etapas del cáncer, no se ha descrito claramente un método claro de clasificación para evaluar las etapas de progresión tumoral en epitelios discales imaginarios. Por lo tanto, también proponemos un método de diagnóstico para clasificar los fenotipos clonales pro-tumorales inducidos en el epitelio del disco ala en tres categorías: hiperplasia (acumulación de un número excesivo de células de aparición normal con aumento de la proliferación), displasia (tejido premaligno compuesto de anormalmente aparente Células), y neoplasia (tumor benigno o maligno compuesto de células que tienen un aspecto anormal y un patrón de proliferación anormal).
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema GAL4-UAS es una de las herramientas genéticas más potentes para la expresión génica dirigida en Drosophila 26 y facilita en gran medida la inducción y el análisis de células tumorales in vivo 4 . Este sistema permite la generación de clones que tienen knockdown de genes supresores de tumores o sobreexpresión de oncogenes dentro de tejido epitelial de tipo salvaje, una situación muy similar a las etapas iniciales de cáncer humano en d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a J. Vaughen por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de JSPS KAKENHI Grant Números 26891025, 15H01500 y la Fundación de Ciencias de Takeda Subvención de investigación a YT
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
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