펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석
Summary
이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
히스톤 단백질에 대한 번역 후 변형 (PTMs)은 염색질 구조 및 유전자 발현 조절에서의 역할에 대해 널리 연구되고있다. 히스톤 PTM에 특이적인 항체의 대량 생산 및 분포는 이러한 표지에 대한 연구를 크게 촉진시켰다. 히스톤 PTM 항체는 많은 염색질 생화학 분야의 주요 시약이기 때문에 항체 특이성의 엄격한 분석이 정확한 데이터 해석과 현장에서의 지속적인 진보에 필요합니다. 이 프로토콜은 히스톤 항체의 특이성을 프로파일 링하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을위한 통합 파이프 라인을 설명합니다. 이 절차의 설계 및 분석 측면은 Microarray 인쇄 형식의 사용자 정의를 간소화하기 위해 최근 개발 한 오픈 소스 및 대화 형 소프트웨어 패키지 인 ArrayNinja를 사용하여 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 파이프 라인은 상업적으로 이용되고 널리 사용되고있는 히스톤 PTM 항체이 실험에서 생성 된 데이터는 온라인 및 확장 Histone Antibody Specificity Database를 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다. 히스톤을 넘어, 여기에 기술 된 일반적인 방법론은 PTM 특이 적 항체의 분석에 광범위하게 적용될 수 있습니다.
Introduction
게놈 DNA는 히스톤 단백질이있는 진핵 세포 핵 내부에 우아하게 포장되어 염색질을 형성합니다. 염색질의 반복적 인 아 단위는 히스톤 단백질 (H2A, H2B, H3 및 H4 1) 의 8 량체 핵 주위에 감싸 진 147 염기쌍의 DNA로 구성된 뉴 소솜 (nucleosome)이다. 크로마 틴은 느슨하게 패킹 된 진균 염색체와 단단히 채워진 헤테로 크로마 틴 도메인으로 광범위하게 구성됩니다. 염색질 압축 정도는 단백질 기계가 복제, 전사 및 수리와 같은 기본적인 DNA 템플릿 공정을 수행하기 위해 기본 DNA에 접근 할 수있는 정도를 조절합니다.
염색체의 맥락에서 게놈 접근성의 주요 조절 인자는 히스톤 단백질 2 , 3 의 구조화되지 않은 꼬리와 핵심 부위의 PTM입니다. 히스톤 PTM은 염색질 4 의 구조에 직접적으로 영향을 미치고 간접적으로 기능합니다.염색질 개질, 효소 및 스캐 폴딩 활동을하는 독자 단백질 및 관련 거대 분자 복합체의 모집 5 . 지난 20 년간 히스톤 PTM 기능에 대한 연구는 세포의 운명, 유기체 발달 및 질병의 시작 / 진행을 조절하는 데 중요한 역할을한다는 것을 압도적으로 제안합니다. 질량 분석 기반 단백체 기술의 발전에 힘 입어, 80 명 이상의 서로 다른 히스톤 잔류 물에 20 개 이상의 고유 한 히스톤 PTMS는 6 발견되었다. 주목할 만하게,이 수정은 수시로 조합에서 생기고, "히스톤 부호"가설과 일치하여, 수많은 학문은 독자 단백질이 히스톤 PTMs의 특정한 조합의 승인을 통해 염색질의 불연속 지역에 표적으로 한 ㄴ다는 것을 건의한다 7 , 8 , 9 . 앞으로 나아갈 핵심 과제는 gr에 함수를 할당하는 것입니다.히스톤 PTM의 목록을 작성하고 히스톤 PTM의 특정 조합이 염색질과 관련된 동적 기능을 조율하는 방법을 결정할 수 있습니다.
항체는 히스톤 PTM의 검출을위한 lynchpin 시약입니다. 이와 같이, 염색질 생화학 연구에 사용하기 위해 1,000 개 이상의 히스톤 PTM 특이 적 항체가 상업적으로 개발되었습니다. 고효율 DNA 시퀀싱 기술의 급속한 발전으로이 시약은 ChIP-seq (염색질 면역 침전 및 차세대 시퀀싱)에서 개별 조사자와 대규모 후성 유전체학 "로드맵"이니셔티브 ( 예 : ENCODE 및 BLUEPRINT)에 광범위하게 사용되고 있습니다 ) 파이프 라인은 히스톤 PTM 분포 게놈 전체의 고해상도 공간 맵을 생성합니다 10 , 11 . 그러나 최근의 연구에 따르면 히스톤 PTM 항체의 특이성은 매우 다양 할 수 있으며 이러한 시약은 unfones 오프 – 타겟 에피토프 인식, 이웃 PTM에 의한 강한 긍정 및 부정적인 영향, 특정 잔기 ( 예 : 모노 -, 디 – 또는 트리 – 메틸 리신)의 변형 순서 식별 어려움과 같은 유용한 특성 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . 따라서 히스톤 PTM 특이 적 항체 시약의 엄격한 품질 관리가 이러한 유용한 시약으로 생성 된 데이터를 정확하게 해석하는 데 필요합니다.
Microarray 기술은 높은 처리량, 재현성 및 소형화 된 포맷으로 수천 개의 거대 분자 상호 작용을 동시에 조사 할 수있게합니다. 이러한 이유로, 단백질 -DNA 19 을 분석하기 위해 다양한 마이크로 어레이 플랫폼이 만들어졌으며 ,"> (20), 단백질 – 단백질 21 단백질 펩타이드의 상호 작용 (22). 실제로, 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이는 작가, 지우개의 높은 처리량 프로파일 링을 가능하게 염색질 생화학 연구에 대한 정보를 검색 플랫폼으로 등장, 그리고 히스톤의 독자 PTMS 15있다 , 23, 24, 또한 히스톤 항체 특이성의 분석을 위해 17, 25. 염색질과 후성 유전학 연구에 자신의 응용 프로그램을 넘어, 히스톤 펩타이드 배열은 전신성 홍 반성 루푸스 등의자가 면역 질환에 대한 진단 / 예후 테스트 잠재적 인 유틸리티가 어디 방지 염색질자가 항체가 생성됩니다 26 , 27 .
여기서는 설계, 제작 및 큐를 위해 개발 한 통합 파이프 라인을 설명합니다.히스톤 및 그 PTM을 인식하는 항체에 대한 특이성 프로파일을 생성하기 위해 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이를 제조한다. 파이프 라인은 ArrayNinja, 마이크로 어레이 실험 (28)의 설계 및 분석 단계를 통합하는 오픈 소스, 우리는 최근에 개발 된 대화 형 소프트웨어 응용 프로그램에 의해 촉진된다. ArrayNinja는 Google 크롬에서 가장 잘 작동합니다. 간단히 말하면, 로봇 접촉 마이크로 어레이 프린터를 사용하여 스트렙 타비 딘 – 코팅 된 유리 현미경 슬라이드상의 한정된 위치에 비오틴 – 컨쥬 게이트 된 히스톤 펩타이드의 라이브러리를 침착시킨다. 그런 다음 항체 – 항원 결정기 상호 작용을 조사하기 위해 경쟁적이고 평행 한 분석 형식으로 배열을 사용할 수 있습니다 ( 그림 1 ). 펩타이드 라이브러리는 PTM (라이신 아세틸 화, 라이신 / 아르기닌 메틸화, 및 세린 / 트레오닌 인산화)이있는 수백 가지의 독특한 합성 펩타이드와 프로테오믹스 데이터 세트에서 주로 유래 된 적절한 조합으로 구성됩니다. 펩타이드 합성 및 검증 방법 다른 곳에서 (23)에 자세히 설명되어 있습니다. 이 어레이 플랫폼을 사용하는 진행중인 히스톤 PTM 항체 스크리닝 작업에서 생성 된 데이터는 공개 웹 리소스 인 Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com)에 보관됩니다. 특히,이 프로토콜의 변형으로 제작 된 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이는 히스톤 PTM 판독기 도메인 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 의 활성을 특성화하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. PTM 작성자 및 지우개 활동 24 .
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그림 1 : 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이에서 항체 스크리닝을위한 Stepwise 절차의 카툰 묘사. 정의 된 번역 후 변형 (적색 및 청색 원)을 갖는 비 오티 닐화 히스톤 펩타이드는 스트렙 타비 딘 – 코팅 된 유리상에 바이오틴 – 플루오 레세 인과 함께 인쇄된다. 양성 상호 작용은 적색 형광으로 시각화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
생물 의학 연구 분야의 항체 신뢰도가 가장 중요합니다 46 , 47 . 이것은 히스톤 PTM의 풍부성과 분포를 특성화하기 위해 개발 된 대부분의 기술에 대한 핵심 도구로서 항체의 위치를 고려할 때 염색질 생화학에서 특히 그렇습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 히스톤 PTM 항체 특이성을 분석하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 반 안델 연구소 (Van Andel Research Institute)와 국립 보건원 (CA181343)에서 SBR
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
Riferimenti
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
- Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -. M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
- Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
- Stunnenberg, H. G., Hirst, M. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
- Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
- Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the “histone code” . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
- Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
- Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
- Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
- Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. “On silico” peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
- Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
- Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
- Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
- Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
- Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
- Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
- Kim, H. -. S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
- Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
- Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
- Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
- Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
- Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
- Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
- Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
- Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -. L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
- Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
- Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
- Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
