मैकेनिकल टिशू डिसोसिएशन और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा स्तनधारी नर मृदा कोशिकाओं की बहुपक्षीय शोधन के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण
Summary
यह काम विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों के वृषण ऊतक से शुद्ध जर्म सेल आबादी प्राप्त करने के लिए एक विधि के मानकीकरण का वर्णन करता है। यह एक सरल प्रोटोकॉल है जो मैकेनिकल टेस्टिस डिज़ेबेशन को जोड़ती है, होच्स्ट -33342 और प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ धुंधला हो जाना, और एफएसीएस सॉर्टिंग, पुरुष प्रजनन जीव विज्ञान के तुलनात्मक अध्ययनों में व्यापक अनुप्रयोगों के साथ।
Abstract
प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) स्तनधारी वृषण कोशिका कोशिकाओं की समृद्ध आबादी को अलग करने के लिए पसंद के तरीकों में से एक है। वर्तमान में, यह उच्च उपज और शुद्धता के साथ 9 म्यूरीन जर्म सेल आबादी के भेदभाव की अनुमति देता है। शुक्राणुजनन के दौरान क्रोमैटिन संरचना और मात्रा में अद्वितीय परिवर्तनों के कारण भेदभाव और शुद्धि में यह उच्च संकल्प संभव है। ये पैटर्न फ्लोरोसेंट डीएनए बाध्यकारी रंजक जैसे होकस्ट -33342 (होकस्ट) के साथ दागकर नर जर्म कोशिकाओं के प्रवाह cytometry द्वारा कब्जा किए जा सकते हैं। ये स्तनधारियों वृषण वृषण कोशिकाओं को अलग करने के लिए हाल ही में विकसित प्रोटोकॉल का विस्तृत वर्णन है। संक्षेप में, एकल कोशिका निलंबन यांत्रिक पृथक्करण द्वारा वृषण के ऊतकों से उत्पन्न होते हैं, डबल होईक्स्ट और प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ दाग और प्रवाह कोशिकामितीय द्वारा संसाधित। विभिन्न डीएनए सामग्री (एचईसीएस तीव्रता) के साथ जीवित कोशिकाओं (पीआई नकारात्मक) के चयन सहित एक सीरियल गेटिंग रणनीति, मैंएस एफएसीएस के दौरान 5 जर्म सेल प्रकार तक भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। इनमें शामिल हैं औसत सूक्ष्मता मूल्यांकन (माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन द्वारा निर्धारित): शुक्राणु (66%), प्राथमिक (71%) और माध्यमिक (85%) शुक्राणुओं, और शुक्राणुओं (90%), आगे राउंड (9 3%) में विभाजित और बढ़ाव (87%) उप-जनसंख्या पूरे वर्कफ़्लो का निष्पादन सीधा है, उचित एफएसीएस मशीन के साथ-साथ 4 सेल प्रकारों के अलगाव की अनुमति देता है, और 2 घंटे से कम में किया जा सकता है। पूर्व विवो कोशिकाओं के फिजियोलॉजी को संरक्षित करने के लिए प्रोसेसिंग का समय कम होना महत्वपूर्ण है, इस पद्धति में नर जर्म सेल बायोलॉजी के डाउनस्ट्रीम हाई-थ्रूपुट अध्ययन के लिए आदर्श है। इसके अलावा, स्तनधारी जर्म कोशिकाओं के multispecies शुद्धि के लिए एक मानक प्रोटोकॉल चर के तरीकों के स्रोतों को समाप्त कर देता है और विभिन्न जानवरों के मॉडल के लिए अभिकर्मकों के एक सेट का उपयोग करने की अनुमति देता है।
Introduction
शुक्राणुजनन प्रगति के इन विट्रो सिस्टम प्रतिनिधि की कमी को देखते हुए, और वृषण में महान सेलुलर विविधता की उपस्थिति, नर रोगाणु कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के समृद्ध आबादियों को अलग करने के लिए मजबूत तकनीकों की आवश्यकता होती है। इस प्रयोजन 1 , 2 , 3 , 4 , 5 के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है क्योंकि यह उच्च उपज और शुद्धता प्रदान करता है, और रोगाणु सेल प्रकारों की संख्या में अन्य अलगाव विधियों को पार करता है जो इसे पहचान सकते हैं और 6 , 7 , 8 का चयन करें प्रवाह कोशिकामितीय विश्लेषण का सिद्धांत एकल कोशिकाओं के लेजर बीम उत्तेजना के बाद अंतर प्रकाश पैटर्न का पता लगाने पर आधारित है। एक सेल के रूप में लेजर के माध्यम से गुजरता है, यह प्रतिबिंबित करता है / स्कैटर प्रकाशसभी कोणों पर, सेल आकार (आगे बिखराव, एफएससी) और इंट्रासेल्यूलर जटिलता (साइड स्कैटर, एसएससी) के आनुपातिक। प्रवाह साइटमैट्री पर विस्तृत जानकारी के लिए ऑरमेरोड 9 देखें।
शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में नर जर्म कोशिकाओं डीएनए सामग्री, क्रोमेटिन संरचना, आकार और आकार में विशिष्ट संशोधनों से गुजरती हैं। इस प्रकार, विशिष्ट सेल आबादी को पहचान लिया जा सकता है और फ्लोरोसेंट रंजक 10 , 11 के साथ प्रकाश बिखरने और डीएनए धुंधला के संयोजन के द्वारा अलग किया जा सकता है। इस प्रयोजन के लिए कई रंगों का इस्तेमाल किया जा सकता है (गीजरिंग और रॉड्रिग्ज़-कसूरीगा 3 में समीक्षा की गई), जैसे होकस्ट -33342 (होचस्ट), जिसे पिछले दशक 1 , 2 , 4 , 10 से वृषण कोशिकाओं के प्रवाह कोशिकामितीय विश्लेषण में अक्सर प्रयोग किया जाता है , 12 Upoयूवी प्रकाश के साथ एन उत्तेजना, होक्स्ट सेलुलर डीएनए सामग्री के लिए आनुपातिक नीली प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है, जबकि अभी तक लाल प्रतिदीप्ति क्रोमेटिन संरचना और संयोग 1 , 13 , 14 में परिवर्तनशीलता को दर्शाती है। नतीजतन, एचईसीएससी के दाग वाले एकल सेल निलंबन (हो-एफएसीएस; 1 , 12 ) के एफएसीएस के दौरान भेदभाव के विभिन्न चरणों में पुरुष जर्म कोशिकाओं के विशिष्ट पैटर्न प्रदर्शित होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि शुक्राणुओं के दौरान केवल सक्रिय होने वाले डाई फुलक्स की एक तंत्र के कारण, होशेस्ट ब्लू फ्लोरोसेंस की तीव्रता इन कोशिकाओं में क्रोमेटिन सामग्री का आनुपातिक नहीं है, और वे हो-एफएसीएस 15 के दौरान एक आबादी के रूप में क्लस्टर हैं। इसके अलावा, गैर-पारगम्य डाई प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ हईचस्ट स्टैनिंग के संयोजन में उपयोगकर्ताओं को एफएसीएस 1 के दौरान मृत (पीआई पॉजिटिव) कोशिकाओं से लाइव (पीआई नकारात्मक)Sup>, 2 , 10 , 12 इस रणनीति का इस्तेमाल पहले वृषण वृक्क कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण में किया गया है और माउस में बड़े पैमाने पर अनुकूलित किया गया है ताकि 9 कोशिकाओं के सेल प्रकार के साथ भेदभाव किया जा सके, जिनमें अर्धसूत्रीविभाजन I 1 , 2 , 4 , 16 के 4 विभिन्न चरणों में कोशिकाएं शामिल हैं। इस काम के उद्देश्य के लिए, हईचस्ट स्नेनिंग के तीन मुख्य लाभ हैं। सबसे पहले, माउस-मॉडल 1 , 2 , 12 , और चूहे और गिनी पिग 17 , 18 , 1 9 जैसे अन्य कृन्तकों में नर जर्म कोशिकाओं के अलगाव के लिए हो-एफएसीएस सफलतापूर्वक लागू किया गया है। दूसरा, हईचस्ट एक सेल-पारगम्य डाई है और इसे झिल्ली परमिटिएजीज़ की ज़रूरत नहीं है, इसलिए यह प्रीपररVes सेल अखंडता अंत में, हेक्स्ट ने डीआईए और प्रोटीन के अलावा डीएनए 1 , 20 , डीएनए अनुक्रम 1 , 20 को प्राथमिकतापूर्वक पाली (डी [एटी]) डीएनए अनुक्रमों को संरक्षित करने के लिए आरएनएई उपचार की आवश्यकता नहीं है, और इसके अतिरिक्त जीवाणु के आगे की ओर के आणविक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कोशिका विशिष्टीकरण।
फ्लो साइटमैट्री में जीवाइज़र और रॉड्रिग्ज़-कसूरीगा 3 में समीक्षा किए गए डीएनए प्लॉएडे और / या डेनटेबिलिटी में समानता के बावजूद, फ्लो साइटमैट्री द्वारा नर जर्म सेल अलगाव के लिए वर्णित प्रोटोकॉल में परिवर्तनशीलता का एक अच्छा सौदा रहा है। अलग-अलग अध्ययनों ने ऊतक विघटन के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है, और विभिन्न डीएनए बाध्यकारी रंजक (अकेले या संयोजन में) और विभिन्न मॉडल जीवों में मुख्य रूप से माउस, चूहा और गिनी पिग में एफएसीएस गटिंग रणनीतियों का इस्तेमाल किया है। इसलिए, विभिन्न प्रजातियों के लिए एकत्र किए गए आंकड़ों की प्रत्यक्ष तुलना अनको से प्रभावित हो सकती हैबेकार तकनीकी कलाकृतियों, जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तनशीलता के बीच अंतर है। महत्वपूर्ण बात, स्तनधारी शुक्राणुजनन (2 एन -4 एन-2 एन-1 एन) में क्रोमैटिन गतिशीलता के हड़ताली संरक्षण से पता चलता है कि एक मानक प्रोटोकॉल को विविध प्रकार के स्तनधारी प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है।
इस अध्ययन का लक्ष्य एक एकल वर्कफ़्लो को विकसित करना था जो विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों पर लागू होता है, जो पिछली बार प्रकाशित तकनीकों को जोड़कर और अनुकूल करते हुए 2 , 20 ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक विधि का मानकीकरण, एंजाइमेटिक पाचन 5 के लिए आवश्यक प्रजातियों-विशिष्ट समायोजन की आवश्यकता से उबरने के लिए यांत्रिक पृथक्करण के द्वारा प्राप्त किया गया था। यह उल्लेखनीय है कि कृत्रिम वृषण वृषण के यांत्रिक पृथक्करण एंजाइमेटिक टिशू पाचन 20 से बेहतर प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है और दोनों तरीकों के प्रदर्शन से उत्पन्न एकल सेल निलंबन के हो-एफएसीएसयह तुलनीय परिणाम 5 सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, यह प्रोटोकॉल 5 जर्म सेल आबादी तक अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स का वर्णन करता है: शुक्राणुता (एसपीजी); प्राथमिक (एसपीसी I) और माध्यमिक शुक्राणुशोधन (एसपीसी II), और शुक्राणु (एसपीडी) – गोल (आरएसपीडी) और बढ़ाव (ईएसपीडी) महत्वपूर्ण बात, प्रयोगशाला में यह आसान है कि ऊतक विघटन के लिए प्रणाली और यूवी लेजर से लैस एक सेल सॉर्टर तक पहुंच की मुख्य आवश्यकता के साथ। यह वर्कफ़्लो ( चित्रा 1 ) तेज और सीधा है और 2 से कम समय में ताजे वृषण के ऊतकों से 4 जर्म सेल आबादी के साथ-साथ अलगाव की अनुमति देता है। आगे की बहाली प्रक्रियाओं के लिए सेलुलर अखंडता बनाए रखने के लिए कम संसाधन समय महत्वपूर्ण है इसके अलावा, 5 अलग-अलग प्रजातियों में इसका सफल प्रदर्शन बताता है कि यह व्यापक रूप से स्तनधारी clade के भीतर लागू किया जा सकता है, यह स्तनधारी पुरुष प्रजनन biol के तुलनात्मक अध्ययन के लिए रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने के लिए आदर्श तरीका है।सादृश्य।
यह प्रोटोकॉल प्रारंभिक कदमों से अलग तीन प्रमुख वर्गों से बना है: (1) वृषण के ऊतक के यांत्रिक विघटन और (2) होक्स्ट और पीआई के साथ टेस्टिकुलर कोशिकाओं के धुंधला हो जाना, इसके बाद (3) एफएसीएस प्रासंगिक शुक्राणु कोशिकाओं का वर्गीकरण करता है। इकट्ठा किए जाने के बाद, विभिन्न स्तनधारी वृषण कोशिकाओं के इन समृद्ध आबादी का उपयोग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि कई अलग-अलग स्तनधारी प्रजातियों के नर जर्म कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए "एक आकार सभी फिट बैठता है" पृथक्करण विधि। अध्ययन के प्रकार के आधार पर उपयोगकर्ताओं को पृथक रोगाणु कोशिकाओं के साथ व्यवहार करना चाहते हैं, अन्य मीडिया या बफ़र्स का उपयोग किया जा सकता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल चरण एक पूरे मूरीन टेस्टिस से सिंगल-सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए हैं
Protocol
Representative Results
Discussion
स्तनधारियों में शुक्राणुजनन के दौरान अति-संरक्षित क्रोमैटिन गतिशीलता को देखते हुए, इस काम का लक्ष्य विभिन्न स्तनपायी वृषण टिश्यू ( चित्रा 1 ) से भेदभाव के अलग-अलग चरणों में पुरुष जर्म कोशिक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक कुत्ता परीक्षणों के लिए पहाड़ी पशु अस्पताल (सेंट लुइस, एमओ) का धन्यवाद करते हैं; संग्रह के साथ सहायता करने के लिए चूहे टेस्ट्स और ब्रायन टैपर प्रदान करने के लिए सेंट लुइस (वाशिंगटन) में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में जेसन आंड और डा। टेड सिसरो की प्रयोगशाला; जरेद हार्टॉक और डाइ। नमक की लैब, वाशिंग के लिए गिनी पिग टेस्ट्स; और डॉ। माइकल टैलकोट ने धुआं सुअर वृषण के लिए वाशिंगटन में तुलनात्मक चिकित्सा विभाग में लेखक, सेंट लुईस, एमओ में वॉशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन और बार्न्स-यहूदी अस्पताल के एल्विन जे। साइमन कैंसर केंद्र को भी मानते हैं, जो साइटमैन फ्लो साइटोमेट्री कोर के उपयोग के लिए है, जो कर्मचारियों द्वारा संचालित सेल सॉर्टिंग सेवा प्रदान करता है। साइटमैप कैंसर केंद्र एनसीआई कैंसर केंद्र सहायता अनुदान # पी 30 सीए 9 1842 द्वारा भाग में समर्थित है।
इस शोध को एक एफसीटी डॉक्टरेट फेलोशिप [एसएफआरएच / बीडी / 51 9 5/2011 से एसीएल] के लिए वित्त पोषित किया गया था, संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान [R01HD078641 और R01MH101810 से डीएफसी] और एक एफसीटी अनुसंधान अनुबंध [IF / 01262/2014 से एएमएल]
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
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