Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile
Summary
Bu çalışma, farklı memeli türlerinin testiküler dokusundan saflaştırılmış germ hücresi popülasyonlarının elde edilmesi için bir yöntemin standartlaştırılmasını açıklamaktadır. Mekanik testis ayrışmasını, Hoechst-33342 ve propidyum iyodür ile boyamayı ve FACS sınıflandırmasını birleştiren basit bir protokoldür ve erkek üreme biyolojisi karşılaştırmalı çalışmalarında geniş uygulamalar yapılmıştır.
Abstract
Floresanla aktive hücre ayırma (FACS), memeli testiküler germ hücrelerinin zenginleştirilmiş popülasyonlarının izole edilmesi için tercih edilen yöntemlerden biridir. Şu anda, yüksek verim ve saflık ile 9 murin germ hücresi popülasyonuna kadar ayrım yapılmasına izin vermektedir. Ayrımcılık ve saflaştırma konusundaki bu yüksek çözünürlük, spermatogenez boyunca kromatin yapısındaki ve miktarındaki benzersiz değişiklikler nedeniyle mümkündür. Bu modeller, Hoechst-33342 (Hoechst) gibi flüoresan DNA bağlama boyaları ile boyanan erkek germ hücrelerinin akış sitometrisi ile yakalanabilir. Burada, memeli testiküler germ hücrelerini izole etmek için yakın geçmişte geliştirilmiş bir protokolün ayrıntılı bir tarifi. Kısaca, tek hücreli süspansiyonlar, testis dokusundan mekanik ayrışma ile, Hoechst ve propidyum iyodür (PI) ile çift boyalı ve akış sitometrisi ile işlenerek üretilir. Farklı DNA içeriğine (Hoechst yoğunluğu) sahip canlı hücrelerin seçimi (PI negatif) de dahil olmak üzere seri geçitlendirme stratejisi, iFACS sıralama sırasında 5 germ hücresi türünü ayırt etmek için kullanılır. Buna spermatogonia (% 66), primer (% 71) ve sekonder (% 85) spermatosit ve spermatidler (% 90), ayrıca yuvarlak (% 93) olarak ayrılmış ve uzatma (% 87) alt popülasyonlar. Tüm iş akışının yürütülmesi basittir, 4 hücre türünün aynı anda uygun FACS makinesi ile izolasyonuna izin verir ve 2 saatten daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Azaltılmış işlem süresi, ex vivo hücrelerin fizyolojisini korumak için çok önemlidir; bu yöntem, erkek germ hücresi biyolojisinin aşağı akışlı yüksek verimli çalışma için idealdir. Dahası, memelilerin germ hücrelerinin çoklu spesifik arındırılması için standartlaştırılmış bir protokol, değişkenlerin metodolojik kaynaklarını ortadan kaldırır ve farklı hayvan modelleri için tek bir reaktif kümesinin kullanılmasına izin verir.
Introduction
Spermatogenezis progresyonunu temsil eden bir in vitro sistem eksikliği ve testiste büyük hücresel heterojenlik varlığı göz önüne alındığında, erkek germ hücresi biyolojisi çalışmaları, zenginleştirilmiş belirli hücre tip popülasyonlarını izole etmek için sağlam teknikler gerektirir. Fluoresansla aktive hücre ayırma (FACS), yüksek verim ve saflık sağladığı ve tanımlayabileceği germ hücresi türlerinin sayısındaki diğer izolasyon yöntemlerini aştığı için bu amaçla 1 , 2 , 3 , 4 , 5 yaygın olarak kullanılmıştır ve 6 , 7 , 8'i seçin . Akış sitometrisi analizi ilkesi, tekli hücrelerin lazer ışını uyarılmasından sonra diferansiyel ışık örüntülerinin saptanmasına dayanır. Bir hücre lazerden geçerken ışığı yansıtır / saçar(Ileriye saçılma; FSC) ve hücre içi karmaşıklığa (yan saçılım; SSC) orantılı olarak her açıdan. Akış sitometrisi hakkında ayrıntılı bilgi için Ormerod 9'a bakın.
Erkek germ hücreleri, spermatogenezin farklı aşamalarında DNA içeriğinde, kromatin yapısında, boyutta ve şekle özgü modifikasyonlara maruz kalırlar. Böylece, farklı hücre popülasyonları, ışık saçılması ve DNA boyama ile flüoresan boyalar 10 , 11 ile birleştirilerek tanımlanabilir ve ayrılabilir. Son 10 yılda testis hücrelerinin akım sitometrisi analizinde sıklıkla kullanılan Hoechst-33342 (Hoechst) gibi bu amaçla birkaç boyayı (Geisinger ve Rodriguez-Casuriaga 3'te inceledik) 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoUV uyarısıyla n uyarma, Hoechst, hücresel DNA içeriğiyle orantılı olarak mavi flüoresan yayar; far kırmızı floresans ise kromatin yapısında ve sıkıştırmada değişkenliği yansıtmaktadır 1 , 13 , 14 . Sonuç olarak, farklı aşamalardaki erkek germ hücreleri, Hoechst lekeli tek hücre süspansiyonlarının FACS sırasında özel desenler sergilerler (Ho-FACS; 1 , 12 ). İlginç bir şekilde, spermatogonial evrede sadece aktif olan bir boya akışı mekanizması nedeniyle, Hoechst mavisi flüoresansının yoğunluğu, bu hücrelerdeki kromatin içeriğiyle orantılı değildir ve Ho-FACS 15 sırasında bir yan popülasyon olarak kümelenir. Ek olarak, Hoechst boyamayı geçirgen olmayan boya propidyum iyodür (PI) ile birleştirmek, kullanıcıların canlı (PI negatif) ile ölü (PI pozitif) hücrelerden FACS 1 sırasında ayırt etmelerini sağlarSup>, 2 , 10 , 12 . Bu strateji, testis germ hücrelerinin akış sitometrik analizlerinde daha önce kullanılmış ve mayoozun 4 farklı evresi I 1 , 2 , 4 , 16'da bulunan hücreler de dahil olmak üzere, 9 germ hücresi türünü ayırt etmek için farede geniş kapsamlı olarak optimize edilmiştir. Bu çalışmanın amacı için Hoechst boyamanın üç ana avantajı vardır. Birincisi, Ho-FACS, fare modeli 1 , 2 , 12'de erkek germ hücrelerinin izolasyonuna ve fare ve kobay 17 , 18 , 19 gibi diğer kemiricilere başarılı bir şekilde uygulanmıştır. İkincisi, Hoechst, hücreye nüfuz eden bir boya olup membran permeabilizasyonu gerektirmez, bu nedenle prezervatifHücre bütünlüğünü sağlar. Son olarak, Hoechst öncelikle poli (d [AT]) DNA dizileri 1 , 20'ye bağlandığından RNase tedavisine gerek yoktur; bu, RNA'nın korunması anlamına gelir ve DNA ve proteinlerin yanı sıra mikropların daha aşağı moleküler çalışmaları için de kullanılabilir Hücre farklılaşması.
Memeli türlerin akış sitometrisi analizlerinde gözlenen DNA ploidi ve / veya lekelenme özelliklerine benzerlik göstermesine rağmen (Geisinger ve Rodriguez-Casuriaga 3'te gözden geçirilmiştir ), akış sitometrisiyle erkek germ hücresi izolasyonu için tarif edilen protokollerde iyi değişkenlik mevcuttur. Farklı çalışmalar, doku ayrışması için spesifik protokolleri kullandı ve başta fare, sıçan ve kobay olmak üzere farklı model organizmalardaki farklı DNA bağlama boyalarını (tek başına veya kombinasyon halinde) ve FACS geçiş stratejilerini kullandı. Dolayısıyla, farklı türler için toplanan verilerin doğrudan kıyaslanması sigara içiminden etkilenebilirMetodolojiler arasındaki değişkenlikten kaynaklanan teknik olmayan eserler. Önemli olarak, memelilerin spermatogenezi (2N-4N-2N-1N) boyunca kromatin dinamikleri çarpıcı korunması, standartlaştırılmış bir protokolün çeşitli memeli türlerine çapraz olarak uygulanabileceğini düşündürmektedir.
Bu çalışmanın amacı, daha önce yayınlanmış teknikler 2 , 20'yi birleştirip uyarlayarak, farklı memeli türlerine uygulanabilen tek bir iş akışı geliştirmekti. Doku işleme için bir yöntem Standardizasyon enzimatik sindirim 5 için gerekli olan türe özgü düzeltme gereksinimini ortadan mekanik ayrışmayı gerçekleştirerek elde edilmiştir. Kemirgen hayvan testis dokunun mekanik ayrışma enzimatik Doku sindirimi 20 ve her iki yöntem de Sergi Sergi tarafından üretilen tek hücre süspansiyonlarının Ho-FACS daha iyi bir performans gösterilmiştir dikkat çekicidirKarşılaştırılabilir sonuçlar 5 . Prensip olarak, bu protokol, 5 germ hücresi popülasyonunu izole etmek için kullanılan ayarları açıklamaktadır: spermatogonia (SPG); Primer (SPC I) ve sekonder spermatositler (SPC II) ve spermatidler (SPD) – yuvarlak (rSPD) ve uzatma (eSPD). En önemlisi, ana gereksinimler doku ayrışması ve bir UV lazer ile donatılmış bir hücre sıralayıcıya erişim için olan, laboratuarda uygulanması kolaydır. Bu iş akışı ( Şekil 1 ) hızlı ve basittir ve 4 germ hücresi popülasyonunun taze testis dokusundan 2 saatten daha kısa sürede aynı anda izolasyonuna izin verir. İndirgenmiş işlem süresi, daha ileri prosedürler için hücresel bütünlüğü korumak için çok önemlidir. Ayrıca, 5 farklı türün başarılı bir performans göstermesi, memelilerde yaygın olarak uygulanabileceğini ve memeli erkek üreme biyolü karşılaştırmalı çalışmalar için germ hücrelerini izole etmek için ideal bir yöntem haline getirdiğini göstermektedirlenmiştir.
Bu protokol, hazırlık adımlarının yanı sıra (1) testiküler dokunun mekanik ayrışması ve (2) testiküler hücrelerin Hoechst ve PI ile boyanması ve ardından (3) ilgili spermatogenik hücrelerin FACS sınıflandırılması olmak üzere üç ana bölümden oluşur. Bir kez toplandığında, farklı memeli testiküler germ hücrelerinin zenginleştirilmiş popülasyonları çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu protokol, birçok farklı memeli türünden erkek germ hücrelerini saflaştırmak için "bir boyut uyuyor" ayrışma yöntemini açıklıyor. Kullanıcıların izole edilmiş germ hücreleri ile yürütmek istedikleri türüne bağlı olarak, diğer medya veya tamponlar kullanılabilir. Aşağıdaki protokol adımları, bir tam murin testisinden tek hücre süspansiyonu üretmek içindir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Memelilerde spermatogenez sırasında yüksek oranda korunmuş olan kromatin dinamikleri göz önüne alındığında, bu çalışmanın amacı, farklı memeli testis dokularından farklılaşan farklı evrim safhalarında erkek germ hücrelerini izole etmek için bir protokol geliştirmekti ( Şekil 1 ). Farklı hayvan modellerine tek bir iş akışının uygulanmasının önündeki en büyük engellerden biri, özellikle doku ayrışma protokolleri açısından türlere özel ayarlamalara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar köpek testisleri için Hillside Hayvan Hastanesine (St. Louis, MO) teşekkür eder; Jason Arand ve Dr. Ted Cicero'nun sıçan testisleri sağlamak için Washington Üniversitesi'nde (WashU) bulunan laboratuarı ve koleksiyona yardımcı olmak için Brianne Tabers; Jared Hartsock ve Washwell'de bulunan Dr Salt'ın Laboratuvarı, kobay testisleri için; Ve Minyatür domuz testisleri için WashU'da Karşılaştırmalı Tıp Bölgesinde Dr. Michael Talcott. Yazarlar ayrıca, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Stnes Barnes-Yahudi Hastanesi'ndeki Alvin J. Siteman Kanser Merkezi'ni personel tarafından işletilen hücre sıralama hizmetini veren Siteman Akış Sitometri Çekirdeği'nin kullanımı için kabul ediyorlar. Siteman Kanser Merkezi kısmen NCI Kanser Merkezi Destek Grant # P30 CA91842 tarafından desteklenmektedir.
Bu araştırma, FCT doktora bursu [SFRH / BD / 51695 / 2011'den ACL'ye], Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüsünden [R01HD078641 ve R01MH101810'dan DFC] ve bir FCT araştırma sözleşmesi [IF / 01262/2014 – AML].
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. ‘Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
