Summary
Qui, il potere di un'inserzione casuale transposon-mediata di un elemento di DNA non codificante è stato usato per risolvere la sua ottimale posizione cromosomica.
Abstract
Le posizioni cromosomiche ottimale di un dato elemento di DNA è stato/sono state determinate mediante inserimento casuale transposon-mediata seguita dalla selezione di fitness. Nei batteri, l'impatto del contesto genetico sulla funzione di un elemento genetico può essere difficile da valutare. Parecchi meccanismi, compreso gli effetti topologici, interferenza trascrizionale da geni vicini, e/o dosaggio genico replica-collegato, possono influenzare la funzione di un dato elemento genetico. Qui, descriviamo un metodo che consente l'integrazione casuale di un elemento di DNA nel cromosoma di Escherichia coli e selezionare le posizioni più favorevoli utilizzando una concorrenza crescita semplice esperimento. Il metodo si avvale di un sistema basato su trasposone ben descritto di inserimento casuale, accompagnato da una selezione del clone(s) più adatto nel vantaggio di crescita, una procedura che è facilmente regolabile per esigenze sperimentali. La natura del clone(s) più adatto può essere determinata mediante sequenziamento intero genoma su una popolazione multi-clonale complesso o dal gene facile a piedi per la rapida identificazione di cloni selezionati. Qui, la regione di DNA non codificante DARS2, che controlla l'avvio della replica del cromosoma in e. coli, è stata usata come esempio. La funzione di DARS2 è noti per essere interessati da dosaggio genico replica-collegato; il più vicino DARS2 Ottiene l'origine di replicazione del DNA, diventa più attivo. DARS2 casualmente è stato inserito nel cromosoma di un DARS2-eliminato il ceppo. I cloni risultanti contenente singoli inserimenti sono stati riuniti ed ha gareggiati uno contro l'altro per centinaia di generazioni. Infine, i cloni più adatti sono stati caratterizzati e trovati per contenere DARS2 inserita nella prossimità vicina alla posizione originale di DARS2 .
Introduction
La funzione di qualsiasi elemento genetico può essere influenzata dalla sua posizione nel genoma. Nei batteri, questo dipende principalmente da interferenze dalla trascrizione di geni vicini, topologia del DNA locale e/o dosaggio genico replica-collegata. In particolare, i processi di replicazione del DNA e di segregazione sono controllati, almeno in parte, di regioni cromosomiche non codificanti1e la funzione di queste regioni dipende dalla posizione/contesto genomico. In e. coli, gli esempi sono il sito di dif , necessario per la sorella del cromosoma risoluzione2; Sequenze KOPS, richiesti per di segregazione del cromosoma3; dati, DARS1e regioni DARS2 , necessarie per il controllo della corretta replica cromosomica (sotto; 4). vi presentiamo un metodo che consente il trasferimento casuale, selezione e determinazione del contesto genetico ottimo di ogni singolo elemento genetico, esemplificato qui dallo studio della regione non codificante DARS2 .
In e. coli, DnaA è la proteina di iniziatore responsabile filo del DNA di apertura presso la replica singola origineoriCe per l'assunzione di elicasi DnaB5,6,7. DnaA appartiene alla AAA+ (cioè, ATPasi associata con attività diverse) proteine e può legare ATP e ADP con simile ad alta affinità5. Il livello di DnaAATP picchi a iniziazione8, dove DnaAATP forma un multimer su oriC che innesca il DNA duplex apertura9. Dopo l'inizio, oriC fatta temporaneamente non disponibile per riattivazione a causa del sequestro di un meccanismo che coinvolge l'associazione della proteina SeqA per hemimethylated oriC10,11. Durante il sequestro, il livello di DnaAATP è ridotto di almeno due meccanismi: l'inattivazione normativo di DnaA (RIDA)12,13 e dati-dipendente DnaAATP idrolisi (DDAH)14 ,15. RIDA sia DDAH promuovere la conversione di DnaAATP a DnaAADP. Prima di un nuovo ciclo di iniziazione, DnaAADP è riattivato per DnaAATP alle sequenze specifiche di riattivazione di DnaA (DARS): DARS1 e DARS216,17. Cromosomiche dati, DARS1, regionie DARS2 sono non-codificazione e agire in un modo tipo di chaperon per modulare DnaAATPl'interconversione diADP di /DnaA. Queste regioni, che si trova di fuori l'origine di replicazione, consentono il montaggio di un complesso di DnaA per entrambi l'inattivazione (dati; 14) o l'attivazione (DARS1 e DARS2; 17) di DnaA. L'eliminazione di DARS2 in una cella non altera massa raddoppio tempo ma risultati in replica asincrona iniziazione15,16,18. Tuttavia, DARS2-cellule carenti hanno una palestra costo rispetto ad un altrimenti isogeniche wildtype durante sia concorso di continua crescita in mezzo ricco o durante l'istituzione della colonizzazione dell'intestino del mouse18. Ciò indica che anche i più piccoli cambiamenti nella concentrazione di asincronia/origine hanno un effetto negativo sul fitness batterica. In e. coli, c'è una pressione selettiva per mantenere di simmetria (cioè, due braccia di lunghezza quasi uguale replica) del cromosoma19. I dati, DARS1e DARS2 regioni hanno la stessa distanza relativa di oriC in tutti gli e. coli ceppi sequenziati18, malgrado le grandi variazioni nella dimensione del cromosoma.
Qui, usiamo la regione DARS2 di e. coli come esempio per identificare le posizioni cromosomiche ottimale per la sua funzione. DARS2 è stato inserito il trasposone NKBOR e il risultante NKBOR::DARS2 trasposone successivamente inserito in modo casuale nel genoma di MG1655 ΔDARS2. Abbiamo così generato un insieme di celle, ogni possesso DARS2 collocato in una posizione diversa sul cromosoma. In vitro concorrenza esperimento, dove tutte le celle nell'insieme sono state riunite ed ha Gareggiate contro l'altro durante la crescita continua in LB per un stimato 700 generazioni, è stato effettuato. Il risultato dell'esperimento concorrenza è stato monitorato/determinato tramite Southern blot, gene facile camminare e sequenziamento intero genoma (WGS; Figura 1). Cloni di end-point risolti da gene facile a piedi sono stati caratterizzati mediante citometria a flusso per valutare i parametri del ciclo cellulare. In un'analisi cytometric di flusso, dimensioni della cella, il contenuto di DNA e sincronia di iniziazione può essere misurati per un gran numero di cellule. Durante il flusso cytometry, un flusso di singole cellule passa un fascio di luce della lunghezza d'onda appropriata per eccitare il DNA macchiato, che quindi è contemporaneamente registrato dai fotomoltiplicatori che raccolgono la fluorescenza emessa, una misura del contenuto di DNA, purché il le cellule sono macchiate per il DNA. La luce diffusa diretta è una misura della massa cellulare20.
L'esperimento in vitro concorrenza che vi presentiamo qui è utilizzato per affrontare questioni relative all'importanza della posizione cromosomica e contesto genomico dell'elemento genetico. Il metodo è imparziale e facile da usare.
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Protocol
1. collezione della biblioteca Transposon
Nota: il locus DARS2 cromosomico è stato clonato nel mini Tn 10-base di trasposoni, NKBOR (il pNKBOR) 21, conseguente NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR può essere ottenuta online 22. pNKBOR è un vettore basato su R6K suicidio che richiede l'iniziatore della proteina π per replica 23. Plasmide pJFM1 è quindi in grado di replicare in un ceppo di e. coli (ad es., Dh5α λ pir) contenente una copia cromosomica del gene di pir. Tuttavia, quando pJFM1 si trasforma nel Pir-carenti wildtype MG1655, pJFM1 non può replicare, che portano alla selezione di cloni resistenti alla kanamicina generati da operazioni di inserimento casuale di NKBOR:: DARS2 nel cromosoma batterico. Per semplicità, questi sono denominati DARS2 inserimenti. Vedere la Figura 1 per una presentazione schematica della metodologia.
- Δ electrocompetent MG1655 preparare DARS2 da attivamente sviluppando celle in brodo Lisogenesi (LB), cresciuta a 37 ° C 24.
- Electroporate pJFM1 in Δ di electrocompetent MG1655 DARS2, secondo Gonzales et al. 24
- aggiungere 1 µ g di pJFM1 (a 1 µ l di acqua) a 40 µ l di electrocompetent Escherichia coli MG1655 Δ DARS2 e trasferire questo composto in una cuvetta pre-refrigerati, sterile divario di 0,2 cm. Inserire la provetta nella camera di elettroporazione. Electroporate alle 18 kV, Ω 500 e 25 µF; la costante di tempo deve essere ~5.0 ms e nessun arco deve verificarsi.
- Recuperare rapidamente la sospensione batterica da esso risospendere in 1 mL di brodo LB pre-riscaldato e trasferimento in una provetta da 15 mL.
- Lasciare che le celle recuperare incubando in condizioni di crescita aerato a 37 ° C per 30 minuti, senza selezione antibiotica. I batteri su piastre di agar LB completati con kanamicina 50 µ g/mL di piastra e incubare a 37 ° C durante la notte.
- Contare le colonie dall'elettroporazione: una colonia è considerata uguale a un'inserzione cromosomica trasposone.
Nota: Le colonie possono essere contati dall'occhio o con un contatore di Colonia. Il numero di colonie è inversamente proporzionale alla distanza media che separa i trasposoni situati nel cromosoma di ogni clone. - Aggiungere 1 mL di brodo LB a ciascuna piastra e lavare via tutte le colonie; 1 mL di brodo LB dovrebbe essere sufficiente per lavare via ~ 100.000 colonie. Riutilizzare la stessa 1 mL di brodo LB per aumentare la concentrazione batterica. Piscina tutte le colonie nello stesso tubo 50 mL.
- Vortex il tubo e congelare il materiale di partenza (t = 0). Per congelarlo, mescolare 1 mL di sospensione cellulare con 1 mL di glicerolo al 50% su ghiaccio. Trasferire le provette per asciugare il ghiaccio per 10 min. Una volta che le culture sono congelate, trasferirli in un congelatore a-80 ° C.
Nota: Una concentrazione di cellule di un minimo di 50.000 UFC/mL è previsto in questa fase.
2. Esperimento di concorrenza in LB
- disgelo la libreria trasposone da-80 ° C il ghiaccio. Mix di pipettaggio.
- Trasferire 100 µ l della biblioteca trasposone a 10 mL di LB in una provetta da 15 mL.
- Crescere le cellule, aerate agitando continua (250 giri/min), per 8 h a 37 ° C per fase stazionaria (cioè, OD 600 = ~ 4.0). Regolare questi parametri alle diverse condizioni di crescita, come desiderato.
- Propagare la popolazione batterica da continui trasferimenti in mezzo preriscaldato fresco ogni ~ 10 generazioni. A tale scopo trasferire 10 µ l della coltura precedente fase stazionaria a 10 mL di LB fresco e crescente per un altro 8 h per la fase stazionaria (cioè, OD 600 = ~ 4.0).
Nota: Come la densità ottica di inizio e di fine sono gli stessi, una diluizione 1000 volte corrisponde a ~ 10 generazioni di crescita (2 10 = 1.024). La popolazione batterica può essere propagata direttamente in mezzo fresco preriscaldata o salvata a 0-4 ° C (su ghiaccio) e propagato il giorno seguente. LB è stata usata qui per garantire accoppiamenti cellulare come molti nel più breve tempo possibile (un tempo di raddoppiamento vicino 22min). - Dopo ogni 100 generazioni della concorrenza, salvare cinque campioni di 1 mL a-80 ° C (come descritto al punto 3.3).
- Se le differenze di fitness tra celle contenenti gli inserimenti trasposone individuali dovrebbero essere piccoli, mantenere la durata del concorso lungo; qui, 700 generazioni (t = 700) sono stati usati.
3. L'analisi del sud della macchia per monitorare la concorrenza esperimento nel tempo
- preparare la sonda per il Southern blot (sezione 1 kb della NKBOR) eseguendo utilizzando primers specifici per l'amplificazione della polimerasi reazione a catena (PCR): NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat e NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
- Incubare a 98 ° C per 30 s per denaturazione iniziale. Quindi, eseguire 35 cicli a 98 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 45 s. Per l'estensione finale, utilizzare 72 ° C per 10 min.
Nota: Il modello per la reazione di PCR è stato un di plasmide purificato pNKBOR 21. - Etichetta il risultante frammento PCR con [α - 32P] dATP utilizzando il sistema casuale dell'iniettore, secondo Smith 25.
- Incubare a 98 ° C per 30 s per denaturazione iniziale. Quindi, eseguire 35 cicli a 98 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 45 s. Per l'estensione finale, utilizzare 72 ° C per 10 min.
- Preparare il DNA cellulare totale secondo Løbner-Olesen e von Freiesleben 26 per t = 0 e selezionato tempo punti fino a t = 700 stimato generazioni della concorrenza.
- Digerire il DNA cellulare totale con Pvu I, che taglia il NKBOR contenente la regione di interesse una volta solo in un'area non coperta dalla sonda; 1 unità di Pvu posso essere utilizzato completamente digest 1 µ g di DNA substrato.
Nota: La sonda riconoscerà frammenti contenenti parte del trasposone, insieme a DNA cromosomico di varie lunghezze, a seconda del sito di inserimento. - Eseguire una macchia del sud usando un gel di agarosio 0,7% secondo Løbner-Olesen e von Freiesleben 26.
4. Identificazione dei cloni più adatto
- gene facile di uso a piedi, come descritto da Harrison et al. 27, per identificare i siti di inserimento di DARS2 da singoli cloni (isolati su piastre LB) dopo 700 generazioni stimate della concorrenza; le bande più la macchia del sud, i più isolati sono necessarie per coprire tutti gli inserimenti di trasposoni.
- Isolato del DNA genomico per modello di PCR. Diffondere i batteri su una piastra di agar LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL e incubare a 37 ° C durante la notte. Crescere colonie singoli pernottamento in libbra di brodo a 37 ° C e successivamente trasferire 20 µ l in 200 µ l di acqua distillata in autoclave (o utilizzare la purificazione del DNA, come descritto al punto 3.2).
- Vortex per mescolare. Riscaldare la miscela a 100 ° C per 10 min e centrifugare a massima velocità per 5 min, salvare la cella lysata a-20 ° C per un uso futuro.
- Disegnare tre primers nidificati tempri entro il trasposone di scelta (vedere la Figura 2 per una rappresentazione grafica della strategia PCR).
Nota: Progettazione degli iniettori annidati dovrebbe garantire che nidificato Primer 3 giace più vicino al noto 5 ' fine del trasposone DNA, seguita da Nested Primers 2 e 1. La spaziatura tra nidificati Primer 3 e il 5 ' fine del noto transposon DNA dovrebbe essere sufficiente per un read-through sequenza dal DNA noto al DNA sconosciuto (per trovare il sito di inserzione del trasposone cromosomiche specifiche). Per NKBOR sono stati utilizzati i seguenti primer nidificati: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg e pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Primer casuale contenente i siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione noti sono utilizzati anche. Per garantire un risultato, si dovrebbe usare almeno due diversi primer casuale. I siti di restrizione per gli enzimi di restrizione (e.g.,Sau 3AI e Hin dIII) devono essere posizionati ai 3 ' fine e preceduta da dieci basi casuale così che 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' e 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' sono i primer contenente un sito di 3AI Sau (GATC) e un sito di dIII Hin (AAGCTT), rispettivamente, dove N = A, T, G o C.
Reazione di PCR di - uso 200 ng di DNA genomico in un 20 µ l. Incubare a 98 ° C per 30 s per la denaturazione iniziale. Eseguire 25 cicli a 98 ° C per 30 s, 50 ° C per 15 s e 72 ° C per 4 min. Per l'estensione finale, utilizzare 72 ° C per 10 min. coppie di primer uso composto da uno degli iniettori casuali e nidificati Primer 1.
- Utilizzare coppie di primer composto nidificato 2 Primer e la stessa casuale dell'iniettore dalla seconda amplificazione, usando 1 µ l della sua reazione precedente come modello.
- Ripetere il punto 4.1.4 con coppie di primer composto nidificati Primer 3 e la stessa casuale dell'iniettore.
- Eseguire i prodotti dalla reazione finale di PCR su un gel di agarosio 1.5% e macchia con bromuro di etidio. Tagliare una banda nella gamma 100-800 bp e isolare il DNA utilizzando qualsiasi commerciale gel del DNA estrazione kit secondo il produttore ' direzione s. Risospendere il DNA in 15 µ l di acqua.
Nota: attenzione. Il bromuro di etidio è tossico e deve essere maneggiato con cura. - La band isolata nel passaggio precedente (passaggio 4.1.6), con 3 di Primer nidificato come il primer di sequenziamento, utilizzando Sanger di sequenza sequenziamento presso un fornitore commerciale.
- Isolato del DNA genomico per modello di PCR. Diffondere i batteri su una piastra di agar LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL e incubare a 37 ° C durante la notte. Crescere colonie singoli pernottamento in libbra di brodo a 37 ° C e successivamente trasferire 20 µ l in 200 µ l di acqua distillata in autoclave (o utilizzare la purificazione del DNA, come descritto al punto 3.2).
- Eseguire WGS.
- Eseguire WGS sul totale il DNA Estratto da selezionati campioni raccolti durante l'esperimento di concorrenza, come descritto da Frimodt-Møller et al. 4.
- Eseguire analisi di sequenziamento.
- Align accoppiato-fine legge a 150 Ns contiguo al NKBOR, AF310136.1 1.904 … 2.204 utilizzando Bowtie2 28 con un intervallo tra le sottostringhe seme (S, 1, 1.15) e un numero massimo di caratteri ambigui (L, 0, 0,9).
- Selezionare le letture allineate e poi ri-allineare entrambi Ref MG1655 | NC_000913.3 e NKBOR gb | AF310136 utilizzando blastN 29
- assegnare recepimento posizioni di inserimento alle giunzioni MG1655-NKBOR.
5. Citometria a flusso
- raccogliere campioni per citometria a flusso.
- Equilibrio ogni cultura di mantenerlo nella fase di crescita esponenziale per almeno 10 generazioni. Controllare il OD 600 e assicurarsi che non supera 0,3.
- Raccogliere due tipi di campioni di flusso.
- Per RIF-runout, trasferire 1 mL della coltura in una provetta da 15 mL contenente 30 µ l di RIF-CEF (300 µ g/mL rifampicina e cephalexin 36 µ g/mL disciolto in 12,5 mM NaOH). Lasciarlo a 37 ° C per un minimo di 4 ore di agitazione.
Nota: Rifampicina indirettamente blocca l'avvio della replica di cromosoma consentendo per giri in corso della replica di continuare a terminazione. Cephalexin previene la divisione cellulare, che si traduce in errore di rotazione replica (RIF-eccentricità) e l'accumulo di cellule con cromosomi replicati completamente. Il numero di cromosomi replicati completamente è uguale al numero delle origini al momento del trattamento con rifampicina e cephalexin 20. - Per l'esempio di EXP, trasferimento 1ml di esponenzialmente crescente cultura in una provetta da 1,5 mL su ghiaccio.
- Per RIF-runout, trasferire 1 mL della coltura in una provetta da 15 mL contenente 30 µ l di RIF-CEF (300 µ g/mL rifampicina e cephalexin 36 µ g/mL disciolto in 12,5 mM NaOH). Lasciarlo a 37 ° C per un minimo di 4 ore di agitazione.
- Fissare le cellule come segue. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 15.000 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 100 µ l di Tris ghiacciata 10 mM pH 7.5 e aggiungere 1 mL di etanolo al 77% ghiacciata. Conservare i campioni a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Macchia le celle come segue. Raccogliere 100-300 µ l di cellule fissate mediante centrifugazione a 15.000 x g per 15 minuti rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 130 µ l di " soluzione di macchiatura del DNA " (90 µ g/mL mithramycin, 20 µ g/mL di bromuro di etidio, 10mm MgCl 2 e Tris 10 mM pH 7.5). Mettere i campioni sul ghiaccio e al buio; i campioni sono pronti per l'analisi di citometria a flusso dopo 10 min.
Nota: Altri DNA macchie di bromuro di etidio e mithramycin può anche essere usato 30 , 31. - Determinare l'origine al cellulare, la massa di cella relativi e il relativo contenuto di DNA dall'analisi di citometria a flusso.
- Esegui flusso cytometry, come descritto in precedenza 32. Eseguire RIF-eccentricità ed EXP-campioni usando il produttore cytometer di flusso ' s istruzioni . Per mithramycin - etidio bromuro-macchiato le cellule e, uso eccitazione lunghezze d'onda 395 e 440 nm e raccogliere la fluorescenza sopra 565 nm.
- Per determinare il contenuto di DNA massa e relativo di cella relativo, eseguire gli esempi di EXP per ottenere singolo parametro forward-luce dispersione contro gli istogrammi di numero di cellulare e l'intensità di fluorescenza contro gli istogrammi di numero di cellulare per un minimo di 30.000 eventi corrispondente al segnale cellulare.
- Distribuzione luce diffusa diretta uso del singolo parametro per misurare la relativa media cell mass.
Nota: Luce diffusa diretta è una misura della massa cellulare medio 20. - Distribuzioni di uso fluorescenza intensità singolo parametro per misurare il DNA medio contenuto 20.
- Ottenere la concentrazione di DNA come il rapporto di medio contenuto di DNA per la massa media delle celle 20.
- Determinare il numero di origini per cella.
- Campioni di run RIF-eccentricità per ottenere l'intensità di fluorescenza di singolo-parametro contro cell numeri istogrammi per un minimo di 30.000 eventi corrispondenti al segnale cellulare.
- Distribuzioni di uso fluorescenza intensità singolo parametro per determinare il numero di cromosomi in ciascuna cellula 20.
- Esegui flusso cytometry, come descritto in precedenza 32. Eseguire RIF-eccentricità ed EXP-campioni usando il produttore cytometer di flusso ' s istruzioni . Per mithramycin - etidio bromuro-macchiato le cellule e, uso eccitazione lunghezze d'onda 395 e 440 nm e raccogliere la fluorescenza sopra 565 nm.
- Calcolare l'indice di asincronia (Ai).
- Calcola l'IA, come descritto da Løbner-Olesen et al. 32, usando le distribuzioni di singolo parametro intensità di fluorescenza dei campioni RIF-eccentricità e l'IA formula = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), dove fx è le cellule di frazione con x numero di cromosomi replicati completamente. Considera iniziazioni asincrona quando A > 0.1.
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Representative Results
Una macchia del sud è stato fatto per verificare che DARS2 era distribuito in modo casuale in tutto il cromosoma nella libreria trasposone (t = 0) e che i cloni più adatti sarebbero permangono nel tempo. Il Southern blot è stato effettuato su DNA estratto dal pool del trasposone iniziale (t = 0) e ogni 100 stimato fuori 700 generazioni della concorrenza (Figura 3). Qui, il DNA cellulare totale da ogni punto di tempo è stato digerito con Pvuho degli enzimi di limitazione, noto per tagliare trasposone NKBOR::DARS2 una volta soltanto in una regione non coperta dalla sonda. Il Southern blot è stato sondato con un frammento di DNA radioattivo con etichettato complementare da parte di NKBOR. Come si vede dalla Figura 3, il pool di DARS2 iniziale (t = 0) mancava distinte bande, che mostra che DARS2 è stato inserito in modo casuale in tutto il cromosoma. Nel corso del tempo, un modello è emerso dove la grande piscina iniziale dei cloni DARS2 sviluppato in solo uno o pochi cloni DARS2 persistenza (Figura 3; t = 0 e t = 700).
Nell'esempio riportato, DARS2 inserimento siti dall'esperimento del concorso sono stati identificati usando WGS e gene facile a piedi. Qui, WGS è stata usata per identificare i siti di inserimento dal pool di inizio (t = 0) e dopo 300, 400 e 700 generazioni della concorrenza. Si noti che la copertura nel sequenziamento profondo presente era insufficiente per una mappatura completa dei siti di inserimento a t = 0; Tuttavia, si dà un sottoinsieme rappresentativo del numero totale di inserimenti. WGS ha confermato il risultato del sud della macchia (vale a dire, la selezione dei cloni DARS2 più adatti), terminando con circa il 98% di tutti i DARS2 inserimenti vicino a wildtype DARS2 posizione cromosomica (DARS2 IR di clone e Clone rppH), mentre il restante 2% erano altrove sul cromosoma (Figura 4). Ciò suggerisce fortemente che la posizione di wildtype è ottimale per la funzione DARS2 . A t = 400, un'inserzione è stata trovata sul braccio opposto replica con una distanza quasi identico per oriC come il wildtype DARS2 posizione (Figura 4), ma questo inserimento non è stato recuperato dopo generazioni 700. Così, dosaggio genico replica-collegato non può essere l'unico fattore determinante per la posizione ottimale.
Gene facile camminare è stato utilizzato per identificare i siti di inserzioni DARS2 in singoli cloni isolati dopo 700 generazioni stimate della concorrenza. Qui, i due siti di inserimento DARS2 menzionati sopra (IRDARS2 Clone e Clone rppH) sono stati identificati. Gene facile camminare è stato fatto solo su 20 cloni, e questo spiega perché tutti gli inserimenti di DARS2 siti mappati in WGS non erano identificati. DARS2-carenti cellule precedentemente sono state indicate per avviare la replica in asincronia e avere una diminuzione nella concentrazione di origine relativo wildtype cellule4,16,17, 18. quindi abbiamo usato la citometria a flusso per risolvere la sincronia nell'inizio del contenuto di origine replica e cellulare del DNA per i due ceppi selezionati (DARS2 Clone IR e Clone rppH) che, in entrambi i casi, sono stati restaurati per wildtype livelli (Figura 5). Un esempio rappresentativo di un ceppo che possiede una sola copia di DARS2 situato nel terminus è mostrato (Figura 5E). Qui, la presenza di un elemento di DARS2 nel terminus non ripristinare sincronia o il contenuto di origine cellulare wildtype livelli, mentre il selezionato DARS2 cloni IR e rppH fare.
Figura 1 : Panoramica di metodologia. Presentazione schematica della metodologia. La regione cromosomica DARS2 viene duplicata nella mini Tn10 su pNKBOR, creazione di pJFM1. pJFM1 si trasforma in e. coli MG1655 ΔDARS2, che innesca un inserimento casuale di DARS2 collegato a Tn10 sul cromosoma di Escherichia coli MG1655 ΔDARS2. Circa 70.000 cloni, ciascuno dei quali contiene un diverso inserimento DARS2 cromosomico, sono stati riuniti ed hanno gareggiati direttamente contro l'altro in brodo LB a 37 ° C. L'esperimento di concorrenza diretta in brodo LB è stata eseguita per un stimato 700 generazioni, dove un campione è stato isolato per ogni 100 generazioni di concorrenza diretta. DNA totale è stato Estratto da ogni campione isolato e utilizzato per macchiare del sud e l'identificazione di DARS2 inserimenti da WGS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Presentazione grafica di gene facile camminare. Questa figura illustra un modello di DNA genomico di una sequenza di DNA sconosciuto adiacente a una sequenza nota con siti di innesco per il casuale dell'iniettore e Nested Primers 1, 2 e 3. I risultati della tre amplificazioni successive eseguite utilizzando i tre primer nidificati progettati sono di seguito illustrati. Il prodotto finale (dal 3 ° giro) è sequenziale utilizzando nidificato Primer 3. Questa figura è stata adattata da Harrison et al. 27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Macchia del sud sondato per NKBOR. Analisi del sud della macchia di DARS2 inserimenti in un DARS2-ceppo carente. DNA genomico Estratto da ogni ~ 100 generazioni di concorrenza diretta, a partire da t = 0 e termina alle generazioni 700, sono stati digeriti con Pvuio e gel-frazionato. La macchia è stata ibridata con una NKBOR sonda (Vedi il protocollo). t indica il numero di generazioni di concorrenza. Questa figura è stata adattata da Frimodt-Møller et al. 4. HMW e LMW sono alto peso molecolare e basso peso molecolare del DNA, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Rappresentazione grafica di resolvsiti di inserimenti di trasposoni ed in ΔDARS2. Le posizioni di oriC, dati, DARS1, DARS2 e terC sono indicati. DARS2 inserimento siti in ΔDARS2 a t = 0 (barre nere), t = 400 (barre blu chiaro), t = 500 (barre rosse) e t = 700 (barre verdi), risolto mediante sequenziamento completo del genoma. Questa figura è stata fatta usando DNAPlotter33 ed è stata adattata da Frimodt-Møller et al. 4. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Istogrammi di citometria a flusso rappresentativo dei trasposoni siti trovati gene facile a piedi a t = 700. Le cellule sono state coltivate in terreno minimo AB completato con 0,2% glucosio, 10 µ g/mL tiamina e acidi casamino 0,5% a 37 ° C. Wildtype e ΔDARS2 sono mostrati in A e B, rispettivamente. Derivati del ceppo wildtype MG1655 privo di DARS2 presso il locus originale e invece che trasportano una copia di DARS2 presso il trasposone risolto sito rrpH, IR e il capolinea (terC) sono indicati in C, D ed E, rispettivamente. Questa figura è stata adattata da Frimodt-Møller et al. 4 per mostrare una posizione DARS2 che si traduce in un'anomalia del ciclo cellulare (terC) o che ripristina il fenotipo wildtype(rrpH, IR). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La metodologia utilizzata qui si avvale di tecniche di state-of-the-art di rispondere a una domanda difficile per quanto riguarda la posizione ottimale di genomica di un elemento genetico. L'inserimento casuale dell'elemento genetico (mediata dal trasposone) consente la facile e veloce raccolta di migliaia di cloni, che poi possono essere fatto per competere contro l'altro per selezionare per la posizione ottima dell'elemento genetico studiato (cioè il clone più allenato).
Qui, DARS2 è stato inserito nel mini-Tn10-base di trasposoni, NKBOR. La scelta del trasposone è importante per l'analisi a valle dei siti di inserzioni. Molti trasposoni differenti sono stati utilizzati in esperimenti di sequenziamento (TraDIS) sito di inserimento diretto di trasposoni, come mini-Tn5Km234 e la scelta più popolare, il Himar I Mariner trasposone35, 36 (per una rassegna recente di questo, Vedi van Opijnen e Camilli36). Abbiamo mirato per 70.000 inserimenti casuali iniziali di DARS2, che dà circa un inserimento DARS2 evert 65 bp nel genoma MG1655. Questo può essere regolato facilmente diminuendo o aumentando il pool iniziale delle colonie raccolti.
Qui, abbiamo optato per continui trasferimenti in LB batch colture, ma l'esperimento di concorrenza può essere eseguita anche in un supporto diverso o in condizioni diverse, incluso l'utilizzo di un chemostato37. Inoltre, la procedura può essere modificata per ospitare eventuali condizioni di scelta, tra cui varie sollecitazioni, come lo stress ossidativo, osmotico o antibiotico. Per verificare la presenza di cloni persistenza nel tempo, uno può fare almeno tre cose: WGS; sequenziamento di trasposoni (Tn-Seq); o, come qui, un Southern Blot. Infine, gene facile camminare può essere fatto su alcuni cloni, con l'ulteriore vantaggio che trasposone inserimento siti sono identificati in singoli cloni, tale che l'effetto del sito di inserimento specifico può essere analizzato fenotipico.
La scelta di analisi fenotipica di valutare il risultato di un esperimento di concorrenza dipende dalla regione oggetto dell'inchiesta. Abbiamo usato la citometria a flusso, che è un potente metodo per misurare i parametri del ciclo cellulare dei batteri. Qui, citometria a flusso ha rivelato che le posizioni cromosomiche selezionate di DARS2, (cioè, gli inserimenti di DARS2 chiudere la posizione di DARS2 wildtype) ha provocato la corretta regolazione della replica iniziazione ( cioè, sincronia e concentrazione del DNA). L'ottimale posizione o le posizioni cromosomiche per DARS2 sono state selezionate in parte dovuto il dosaggio corretto gene replica-collegato e in parte a causa dell'ambiente genomico locale favorevole che è importante per DARS2 funzione4.
Qui, un elemento di DNA non codificante è stato studiato, ma questo potrebbe essere esteso a qualsiasi regione di codificazione di scelta. Uno studio recente ha trovato che il livello di espressione genica variato ~ 300 volte, a seconda della sua posizione sul cromosoma, senza deselezionare correlazione a gene collegato replica dosaggio38. L'approccio descritto qui potrebbe dare idea importante della relazione tra la posizione genomica di un particolare gene, sua attività trascrizionale e il vantaggio di idoneità associato. Questo potrebbe in teoria aiutare con la selezione di posizioni genomiche, portando all'espressione più forte di un dato gene, che a sua volta potrebbe essere di interesse per ingegneria ceppi nuovi, migliorati per la produzione di proteine ricombinanti.
Poiché e. coli contiene limitate regioni intergeniche39, inserimenti di trasposone altererà, nella maggior parte dei casi, geni. Questo può occasionalmente creare falsi positivi se il clone(s) più adatto non sono selezionati a causa della posizione cromosomica ottima dell'elemento genetico in questione, ma piuttosto perché un gene è interrotta - che, in altri modi, fornisce un vantaggio di fitness durante la Concorso esperimento4.
Questa metodologia si avvale di un sistema easy-to-use trasposone, dove qualsiasi regione di scelta può essere integrato in modo casuale posizioni. L'esperimento progettato concorrenza può essere modificato per includere un numero qualsiasi di forze di selezione diverso da sviluppo puro, come si vede qui. Il programma di installazione può anche essere modificato per essere puramente basato su Tn-Seq, che produce una maggiore risoluzione di sequenziamento dei siti di inserzioni rispetto WGS, usato qui. Questo approccio imparziale dovrebbe essere usato per delucidare nuove interessanti funzionalità negli organismi atipici così lontano, che potrebbero mostrare che le tendenze comuni presenti nell'organizzazione cromosomica di eubatteri.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun interesse finanziario concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori sono stati finanziati mediante sovvenzioni della Fondazione di Novo Nordisk, la Fondazione di Lundbeck e il Danish National Research Foundation (DNRF120) attraverso il centro per batterica risposta allo Stress e persistenza (BASP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
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