Summary
Ce protocole décrit une méthode permettant d’observer l’embryogenèse chez Arabidopsis via clairance ovule, suivie par l’inspection de la formation embryonnaire sous un microscope.
Abstract
Étant donné la nature hautement prévisible de leur développement, Arabidopsis embryons ont servi comme modèle pour l’étude de la morphogénèse chez les plantes. Cependant, embryons plante au stade précoce sont petites et contiennent peu de cellules, ce qui les rend difficiles à observer et à analyser. On décrit ici une méthode pour caractériser la formation du patron chez les embryons de la plante sous un microscope à l’aide de l’organisme modèle Arabidopsis. Suite à l’apurement des ovules frais à l’aide de la solution de Hoyer, le nombre de cellules dans et la morphologie des embryons pouvaient être observés, et leur stade de développement peut être déterminée par le microscope à contraste interférentiel différentiel à l’aide d’un 100 X lentille d’immersion d’huile. En outre, l’expression de protéines spécifiques de marqueurs taggés avec la protéine fluorescente verte (GFP) a été suivie pour annoter la spécification identité des cellules au cours de la structuration de l’embryon par laser confocal, microscopie à balayage. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour observer la formation de modèles dans des embryons de plante sauvage aux niveaux cellulaires et moléculaires et de caractériser le rôle de certains gènes dans la structuration de l’embryon en comparant la formation du patron chez les embryons de type sauvage et des mutants létaux embryon. Par conséquent, la méthode peut servir à caractériser l’embryogenèse chez Arabidopsis.
Introduction
L’embryogenèse est l’événement plus tôt dans le développement de la plante. Une forme d’embryon mature d’un zygote à travers la division cellulaire et la différenciation sous strict contrôle génétique1,2. Arabidopsis embryons sont un modèle utile pour étudier le contrôle de la morphogenèse, parce que la séquence des divisions cellulaires au cours de l’embryogenèse suit un modèle attendu3,4. Cependant, un embryon d’Arabidopsis contenant un à plusieurs cellules est trop petit pour être observé et analysé. En outre, la mutation de certains gènes peut provoquer embryon létalité5, indiquant le rôle clé de ces gènes dans l’embryogenèse. La caractérisation de la formation chez les mutants létaux embryon fournit une base pour comprendre le mécanisme moléculaire par lequel gènes essentiels réglementent le développement des embryons.
Une méthode détaillée est décrite ici pour la caractérisation de la formation dans la plante modèle Arabidopsis embryon par observation microscopique. La méthode consiste à dégagement ovule, suivie de l’observation microscopique d’un embryon. La caractérisation d’un mutant embryon létale est également décrite.
La morphologie des embryons à des stades différents de développement peut être déterminée directement par microscopie les ovules qui ont été effacées avec solution6,7 de Hoyer. Ces ovules présentent un indice de réfraction élevé ; ainsi, cet ovule méthode de compensation est particulièrement avantageuse pour les échantillons qui doivent être observées au microscope (DIC) de contraste interférentiel différentiel.
En outre, les gènes qui sont exprimés dans une cellule particulière ou un nombre limité de cellules au cours de l’embryogenèse utilisable comme marqueurs pour identifier les cellules de l’embryon. Par conséquent, la spécification d’identité cellulaire au cours de l’embryogenèse peut être annotée en contrôlant l’expression des protéines GFP-étiquetée marqueur laser confocal, microscopie à balayage. À l’inverse, observant le modèle d’expression d’un gène fonctionnelle inconnue - fusion deGFP durant l’embryogenèse peut fournir un lien entre la structuration de l’embryon et l’expression de ce gène et faciliter l’identification de nouveaux gènes qui sont requises pour l’embryogenèse chez Arabidopsis.
La méthode décrite ici peut également être utilisée pour caractériser le phénotype d’un mutant embryon létal et pour déterminer l’impact du gène affecté sur l’embryogenèse au niveau cellulaire. En outre, en combinaison avec une comparaison du modèle d’expression des gènes marqueurs durant l’embryogenèse entre plantes sauvage et mutantes, la méthode peut donner des indices sur les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation impliquées dans l’embryogenèse8,9. En effet, la méthode a été appliquée aux plantes de naa10 , et il a été constaté que la division anormale de l’hypophyse chez le mutant peut être causée par un changement dans la répartition de l’auxine au cours de l’embryogenèse,5.
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Protocol
Remarque : Ce protocole comporte trois parties : 1) observer la formation de modèles dans des embryons de Arabidopsis sauvage à l’aide de la microscopie DIC ; 2) caractérisant l’embryon modèle formation via l’observation de l’expression de protéines de marqueur à l’aide de laser confocal, microscopie ; et 3) déterminer le rôle d’un gène spécifique dans l’embryogenèse (en utilisant le mutant naa10 par exemple).
1. compensation de l’ovule
- Préparation du matériel plante
Remarque : Le protocole décrit ici est un exemple sur comment faire pousser des plantes saines ; autres façons de faire pousser des plantes en bonne santé travaillent également.- Ajouter 100 graines dans un tube de 1,5 mL et puis ajouter 1 mL de 1,5 % d’hypochlorite de sodium (mix 15 mL de chlore de 10 % à 85 mL d’eau) pour stériliser les graines pendant 5 min. inverser le tube plusieurs fois pour s’assurer que la solution et les graines sont bien mélangés pour stériliser les graines surfaces complètement.
- Forcer les graines au fond du tube par centrifugation pendant 30 s à 1 200 g, éliminer le surnageant et lavez les graines avec de l’eau stérile quatre fois à un banc pour enlever l’hypochlorite de sodium résiduel.
- Ajouter 4,4 g de mélange de sels basal milieu de Murashige et Skoog (MS) et 10 g de saccharose à 1 L d’eau ultrapure. Incorporer le mélange pour dissoudre les sels et le saccharose. Ajuster la solution à pH 5,8 avec 1 M KOH, ajouter 3 g de gélifiant, tels que Phytagel, à la solution MS-saccharose et stériliser la solution à 121 ° C pendant 15 min faire le milieu MS.
- Verser 30 mL de milieu MS dans une boîte de Petri de 12 cm pour générer des plaques moyens MS.
- Placez les graines stérilisées sur la plaque de MS. La plaque de transfert vers une chambre de croissance et de conserver la plaque sous conditions de jours longs (22 ° C pendant 16 h, à la lumière et à 18 ° C pendant 8 h dans le noir) après stratification des graines (3 jours à 4 ° C dans l’obscurité).
- Après 8 jours de croissance, transférer les plantes dans le sol (mélange riche en nutriments du sol et la vermiculite dans un rapport 1:1) dans un plateau, couvrir le bac à couvercle blanc, transparent pendant 5 jours pour éviter la perte d’eau et laisser un espace pour éviter la vitrification des plantes.
- Retirer le couvercle du plateau et cultiver les plantes dans une chambre de plain-pied dans des conditions de jours longs (voir 1.1.5). Allumer la lumière à 06:00 et l’éteint à 22:00. Après environ 20 jours de croissance dans la chambre de plain-pied, les plantes seront ont fleuri et produit des siliques.
- Marque les boutons de fleurs avec un fil à la position de la graine les tiges dans l’inflorescence à 20:00 (n’utilisez pas la première à la troisième boutons floraux ; les siliques générés par ces boutons floraux généralement développent quelques graines avortées, et cela peut modifier la proportion de normal d’ovules anormaux). Définir le début de la pollinisation de l’ovule, comme lorsque le bourgeon marqué ouvre à fleurir à 08:00 le lendemain matin.
- Préparation de la solution de Hoyer
- Ajouter 24 g d’hydrate de chloral dans un tube de 50 mL et envelopper le tube entièrement avec du papier aluminium (solutions d’hydrate de chloral ne sont pas stables sous la lumière).
- Ensuite, ajoutez 9 mL d’eau ultrapure et 3 mL de glycérol à la solution ci-dessus et secouer le tube pour dissoudre l’hydrate de chloral. Pour rendre la solution de Hoyer, laisser le tube reposer toute la nuit à température ambiante pour éliminer toutes les bulles.
- Dédouanement et la séparation de l’ovule
- Fixez un morceau de ruban adhésif double-face à une lame de verre de microscope. Placez une silique cultivé pour le nombre de jours après la pollinisation (DAP) sur la diapositive avec le pseudoseptum perpendiculaire à la surface ; cela il sera facile de diviser les carpelles (Figures 1 a et 1 b).
- Diviser les carpelles des deux côtés de la pseudoseptum avec une aiguille de seringue et fixer les deux carpelles disséqués à la diapositive afin que les ovules dans la silique sont visibles sous un stéréoscope (Figures 1 et D 1).
- Administrer 70 µL de solution de Hoyer sur la lame de verre et puis mouiller la pointe d’une paire de pinces à épiler à pointe fine avec une solution de Hoyer en plongeant. En utilisant le stéréoscope, déplacez les ovules dans la solution de la Hoyer sur la diapositive avec la pince à épiler pour nettoyer les embryons. Appliquer une lamelle à la diapositive doucement pour éviter de générer toutes les bulles.
- Mettre la lame finie dans une boîte dans une pièce sombre pendant 2-12 h (plus mature un ovule est, il faudra plus de temps) à la température ambiante. Embryons au stade de 2/4-cellules (DAP 1-2) peuvent être observées au microscope après 2 h, alors que les embryons entre l’octant et globulaires débuts (DAP 3) peuvent être observés après 4 h. Des embryons plus matures (4-8 DAP) peuvent être observées après 12 h.
- Examiner les ovules dégagés à l’aide de la fonction DIC d’un microscope. Recherchez les embryons dans un champ de faible puissance (10 X) et puis changer à un champ de haute puissance (objectif d’immersion d’huile-100 X) pour observer le modèle cellulaire chez les embryons avancés.
- Examiner les embryons à des stades de développement différents.
2. caractérisation de la structuration de l’embryon et identité cellulaire par l’intermédiaire de l’Observation de l’Expression de la protéine marqueur
- Préparation du matériel végétal
- Cloner le promoteur et la séquence de l’élément de réponse marqueur génétique ou hormone de codage et puis il se fusionnent avec une protéine fluorescente (tels que GFP) ; Insérez ensuite la construction dans le vecteur binaire (par exemple, pCambia1300). Ici, l’élément de réponse auxine DR5 est présentée comme un exemple de10.
- Introduire le plasmide DR5-GFP qui en résulte dans les plantes de type sauvage par Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation11. Sélectionner les plantes T1 à l’aide de plaques milieu MS contenant hygromycine (50 mg/mL de liqueur mère, dilué 1:1, 000). Les plantes transgéniques seront présentent de longues racines et génèrent deux feuilles en rosette après 8 jours de croissance dans les conditions décrites aux Articles 1.1.5.
- Transférer les plantes transgéniques dans le sol et les cultiver comme indiqué dans 1.1.6 et 1.1.7.
- Recueillir les graines T2 des lignes T1 indépendants. Semer des graines sur des plaques de MS-hygromycine, sélectionner les plantes portant une copie de l’insertion de DR5-GFP (le ratio de plantes résistantes aux plantes sensibles sera environ 3:1) et les transférer sur le sol.
- Cultiver les plantes T2 comme indiqué dans 1.1.6 et 1.1.7.
- Recueillir les graines T3 provenant des installations de T2. Semer des graines sur des plaques de MS-hygromycine, sélectionner les plantes transgéniques homozygotes (toutes les plantes d’une seule ligne exposera la résistance hygromycine) et les transférer sur le sol.
- Marquer les boutons floraux des plantes T3 homozygotes comme indiqué dans 1.1.8.
- Observation de signal GFP
- Mélanger 3 mL de glycérol à 47 mL d’eau ultrapure pour générer une solution de glycérol de 6 %.
- Fixez un morceau de ruban adhésif double-face à une lame de microscope de verre et fixer une silique comme indiqué à l’alinéa 1.3.1.
- Diviser les carpelles des deux côtés de la pseudoseptum avec une aiguille de seringue et fixer les deux carpelles disséqués à la diapositive sous un stéréoscope comme il est indiqué dans la section 1.3.2.
- Administrer 30 µL de 6 % de glycérol sur la lame de verre et placer tous les ovules de carpelles disséqués dans la solution à l’aide de pinces à épiler à pointe fine. Placez un lamelle couvre-objet sur la diapositive doucement.
- Comme le tégument et l’endosperme dans chaque ovule peuvent empêcher l’observation des signaux GFP dans l’embryon, extraire l’embryon de l’ovule. Cliquez sur la diapositive rapidement et doucement pour extraire l’embryon de l’ovule (plus mature un ovule est, moins de la force doit être appliqué à la diapositive).
- Examiner la lame pour à l’aide de laser confocal, microscopie à fluorescence GFP. Trouvez les embryons isolés sous un champ de faible puissance (10 X) et noter leur emplacement, puis changer à un champ de haute puissance (objectif d’immersion d’huile-100 X) pour observer l’expression DR5-GFP dans les embryons en définissant la source lumineuse de l’excitation à 488 nm pour la détection du signal GFP.
- Détecter l’expression de la GFP dans les embryons pour sélectionner la ligne T3 adaptée pour une analyse ultérieure.
3. caractérisation de la Formation embryonnaire dans un embryon-lethal Mutant via la clairance de l’Ovule et l’Observation de protéine marqueur : Naa10 par exemple
- Structuration d’embryon chez les plantes mutantes naa10
- Préparer les matières végétales comme indiqué dans 1.1.1-1.1.7.
- Identifier les naa10+ / − plantes par PCR avec des amorces spécifiques aux gènes5, puis marquez les boutons floraux de la naa10+ / − plantes comme indiqué dans 1.1.8.
- Effectuer le dédouanement de l’ovule et l’examen microscopique de naa10+ / − embryons figurant aux points 1.2 et 1.3.
- Analyse des protéines marqueur utilisant des embryons naa10
- Obtenir approprié DR5-GFP de lignées transgéniques à l’aide de la procédure décrite au point 2.1-2.2.
- Franchir la ligne transgénique DR5-GFP homozygote avec une naa10+ / − plante pour obtenir naa10+ / − plantes qui sont homozygotes pour le marqueur de fluorescence GFP à la génération F2 (identifiée par PCR du gène-spécifique) pour caractériser naa10+ / −5 et observez le signal GFP au microscope utilisant une ligne DR5-GFP homozygote.
- Marquer les boutons floraux de naa10+ / − plantes qui sont homozygotes pour DR5-GFP comme indiqué dans 2.1.7.
- Rechercher le signal GFP dans des embryons de naa10 qui sont homozygotes pour DR5-GFP comme indiqué au point 2.2.
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Representative Results
La méthode décrite dans cet article peut servir à observer l’embryogenèse directement sous un microscope, annoter les spécifications d’identité cellulaire au cours de l’embryogenèse avec des marqueurs spécifiques et caractériser le rôle d’un gène particulier au cours de l’embryogenèse.
Des résultats représentatifs de l’analyse d’embryon structuration (à partir de l’étape allongée zygote au stade de maturité-bâton de marche) dans type sauvage Arabidopsis sont indiquées à la Figure 2. Après autorisation de l’ovule, les embryons à des stades de développement différents peuvent être distingués par microscopie DIC (Figure 2). Le modèle d’expression de DR5-GFP a été enregistré au cours de l’embryogenèse sous confocal laser scanning microscopy (Figure 3) pour déterminer la répartition de l’auxine dans l’embryon et examiner le rôle potentiel de l’auxine au cours de l’embryogenèse chez Arabidopsis.
Ce protocole permet également de caractériser les rôles des gènes spécifiques au cours de l’embryogenèse. Ici, le rôle de Naa10 au cours de l’embryogenèse chez Arabidopsis a été examiné à titre d’exemple. Une division anormale de l’hypophyse a été observée (division askew et verticale de l’hypophyse en Naa10 par rapport à la division asymétrique transversale de l’hypophyse chez les plantes de type sauvage, Figure 4). La répartition de l’auxine au stade globulaire était presque uniforme dans la plupart des embryons de Naa10 et retenu un signal plus large dans l’hypophyse, par rapport à des embryons de type sauvage (Figure 5). Ces résultats indiquent qu’il faut Naa10 pour l’embryogenèse, et qu’elle pourrait être impliquée dans l’embryogenèse via l’auxine signalisation dans Arabidopsis.
Figure 1 : Schéma de principe pour la Dissection des Arabidopsis Silique. (A) la silique fixé sur la lame de verre a été collé avec un morceau de ruban adhésif double-face. (B) l’image agrandie de la zone a. Les deux lignes imaginaires représentant l’emplacement à se diviser. (C) l’image agrandie de la silique de split dans la zone D. (D) l’image de la silique de split. Veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Examen de l’embryogenèse dans sauvage (Col-0) Arabidopsis par microscopie DIC. (A) allongé zygote. (B), un embryon de stade 1 cellule à 1 DAP. (C), un embryon de stade 2/4-cellules à 2 DAP. (D), un embryon de scène octant à 3 DAP. (E) A dermatogen stade embryon au DAP 3. DAP (F), un jeune embryon stade globulaire à 4. (G), un embryon de stade globulaire fin à 5 DAP. (H) A Coeur stade embryon au DAP 6. (I) un embryon stade de torpille à 7 DAP. (J) un embryon stade bâton de marche à 8 DAP. Barreaux de l’échelle = 10 µm. veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le modèle d’Expression de DR5 dans des embryons de Arabidopsis sauvage (Col-0). (un - d) signaux GFP. (A-D) Fusion d’images avec des images de champ lumineux. DR5 a été exprimé dans le pôle de la racine de la sauvage du stade globulaire (a et A, 4 DAP) et les embryons au stade (b et B, 6 DAP) coeur. DR5 était également exprimée dans les conseils de cotylédons embryonnaires (c et C, 7 DAP) et dans le système vasculaire de mûres sauvage embryons (d et D, 8 DAP). Barreaux de l’échelle = 50 µm. veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractérisation du rôle de Naa10 au cours de l’embryogenèse chez Arabidopsis. Division normale de l’hypophyse dans une usine de type sauvage (A). Une division anormale de l’hypophyse chez les plantes mutantes Naa10 est munie d’une ligne blanche (B) (askew division de l’hypophyse) et (C) (division verticale de l’hypophyse). Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Le modèle d’Expression DR5 stade globulaire sauvage (Col-0) Arabidopsis et d’embryons de Naa10 . (a et b) Signaux GFP. (A et B) Fusion d’images avec des images de champ lumineux. DR5 s’exprimait dans le pôle racinaire d’un embryon stade globulaire sauvage (a et A). DR5 exprimait presque uniformément dans un embryon de Naa10 stade globulaire et conservé le signal plus large dans l’hypophyse par rapport au type sauvage (b et B). Barreaux de l’échelle = 50 µm. veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dégagement de l’ovule est une méthode utile pour détecter la division cellulaire et d’évaluer la morphologie au cours de l’embryogenèse chez Arabidopsis; en utilisant cette technique, les embryons peuvent être observées directement sous DIC microscopie5,12. L’étape critique pour le dédouanement de l’ovule est étape 1.3.4. Le temps nécessaire au dégagement d’ovule dans étape 1.3.4 est variable. Embryons au stade de 2/4-cellules peuvent être clairement observées après 2 h dans une solution de la Hoyer, considérant qu’ils ont l’air indistincts après 12 h. Ainsi, plus mature un ovule est, plus le temps requis pour autorisation.
À l’étape 2.2.5, pour isoler un embryon à partir d’un ovule, la quantité de force exercée sur la diapositive est critique. Les embryons peuvent être écrasés si trop de force est appliquée ; Toutefois, un embryon ne peut être expulsé de l’ovule si trop peu de force est utilisée. Dans notre expérience, un ovule plus mature est, moins de la force est nécessaire. Stade de torpille et embryons matures peuvent être isolés directement par pelage ouvert un ovule à l’aide d’une aiguille de seringue. Certaines cellules du suspenseur pourraient être détruits dans l’embryon isolée au cours du processus d’isolement, le signal de fluorescence provenant du suspenseur peut-être perdues ou incomplètes. Une autre limite de cette méthode est que les embryons avant le stade de 4 cellules étaient difficiles à trouver des embryons extrudés car ils sont trop petits et blindé par fragment de l’ovule.
Le stade de développement et de la morphologie d’un embryon peuvent être affectées par la mutation de certains gènes ; ces effets peuvent être démontrées par microscopie après dégagement de l’ovule. Cette approche aidera à la compréhension du mécanisme moléculaire par dont certains gènes embryogenèse médiate5. Observant le modèle d’expression d’un gène fonctionnelle inconnue - fusion deGFP durant l’embryogenèse peut fournir un lien entre la structuration de l’embryon et l’expression de ce gène et faciliter l’identification de nouveaux gènes qui sont requises pour l’embryogenèse chez Arabidopsis13. Ainsi, le protocole décrit ici fournit une méthode de base pour la caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Jessica Habashi pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions le Dr Xianyong Sheng du centre d’imagerie, Collège des Sciences de la vie, Capital Normal University (Pékin), pour effectuer la localisation de dosage DR5-GFP . Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la Science de le Gouvernement Municipal Beijing (CIT & TCD20150102) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31600248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
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