כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי
Summary
אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.
Abstract
הקביעה של תהליך קיפול חלבונים מרצף חומצות אמיניות שלהם למבנה תלת-ממד מקורי שלהם היא בעיה חשוב בביולוגיה. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן לפתור בעיה זו על-ידי הפעלת מתיחה והרפיה של מולקולות חלבון יחיד, אשר נותן עדות ישירה של התגלגלות, refolding מאפיינים ספציפיים. מבוסס AFM מולקולה בודדת כוח-ספקטרוסקופיה (AFM-SMFS) מספק אמצעים למדוד באופן עקבי הייצורים החיים אנרגיה גבוהה בחלבונים אשר אינן אפשריות במדידות (ביוכימית) בצובר מסורתי. למרות מספר רב של מאמרים פורסמו כדי להציג את העקרונות של AFM-SMFS, זה לא קל לערוך ניסויים SMFS בשל העדר פרוטוקול ומגובה מלאה. במחקר זה, אנו להמחיש בקצרה את העקרונות של AFM, פירוט בהרחבה את הפרוטוקולים, נהלים, ניתוח נתונים כקו מנחה כדי להשיג תוצאות טובות מן הניסויים SMFS. נדגים נציג SMFS תוצאות מדידות התגלגלות מכני חלבון יחיד, אנו מספקים פתרון בעיות אסטרטגיות עבור כמה נפוץ נתקל בבעיות.
Introduction
ההתקדמות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת (SMFS) על ידי AFM אפשרו במחרוזות מכני, אפיון מדויק של מולקולות חלבון יחיד. אפיון זה הפיק הרומן תובנות על חלבון מכניקה1,2, קיפול3, אינטראקציות חלבון-ליגנד4, אינטראקציות חלבון-חלבון5, החלבון ומתוכננים מבוססי חלבונים חומרים6,7,8. SMFS שימושית במיוחד עבור לימוד חלבון התגלגלות, כמו מתיחה על ידי AFM מאפשרת את הקשר הכימי והפיזי בתוך מולקולת חלבון להרחיב בהדרגה על פי שלהם נוקשות, אשר נותן לעלות באורך מתאר גדל ללא הרף. זו מתיחת של מולקולה חלבון יכול לייצר מעבר פתאומי בתוך עקומת כוח-סיומת וכתוצאה אירוע קרע (או לאלץ את שיא). הפסגה כוח נותן מידע ישיר על השינוי כוח מבניים התגלגלות של החלבון במהלך התגלגלות תהליך מכני. אחד המחקרים הראשונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי נמדד titin1 ומצאו היבטים חדשניים של חלבון התגלגלות, refolding בתנאים פיזיולוגיים ללא שימוש denaturants לא טבעיים כמו כימיקלים מרוכזים או טמפרטורות קיצוניות.
SMFS הניסויים נערכים על מגוון מכשירים, אך כאן אנו רואים רק AFM. AFM מורכב ארבעה מרכיבים עיקריים: החללית, הגלאי, המחזיק לדוגמה, הסורק פיזואלקטריים. המכשיר הוא קצה חד על קצה זיז שמתנדנדת חופשי. לאחר כיול, כיפוף הזיז בזמן מתיחות של מולקולה המצורפת נמדד באמצעות קרן לייזר זה משתקף מעל גבי הזיז במדויק לקבוע כוחות באמצעות חוק הוק. הפרויקטים קרן לייזר משתקף לתוך גלאי פוטודיודה רביע אשר מייצר מתח בפרופורציה העקירה של קרן הלייזר מהמרכז דיודה. המצע עם הדגימה החלבון בנוזל נטענה על שלב פיזואלקטריים 3D יכול להיות נשלט עם דיוק תת ננומטר. מחשב קורא את המתח מתוך גלאי פוטודיודה ופקדים השלב 3D דרך ספק מתח מבוקר-מחשב. אלה שלבים למפעיל piezo מצוידים בדרך כלל עם קיבולי או זן-מד חיישני מיקום בדיוק המידה piezo הזחה וכדי היסטרזיס הנכון באמצעות מערכת בקרת הזנה-בחזרה. הפלט אות חיישן של הבקר piezo מומר מרחק באמצעות מתח קבוע piezo זה לבצע כיול במפעל. מעגל הרחבת כוח דוגמה של ניסוי מושך מוצג באיור2.
ישנם שני סוגים של AFM-SMFS ניסויים: מהירות קבועה וכוח קבוע משיכת מדידות. מדידות SMFS כוח קבוע מתוארים Oberhauser. et al. 9, ואילו כאן נתמקד מדידות מהירות קבועה. טיפוסי AFM מהירות קבועה מושך ניסוי נעשית על-ידי אספקת מתח piezo להעביר בעדינות מצע ביחס טיפ זיז. ניסוי טיפוסי כולל הטיפ בהתחלה לוחצת כנגד פני השטח. המדידה מושך הוא התחיל על ידי הזזת את המצע מן העצה להביא איתו קשר. אם חלבון בא במגע עם הטיפ בתחילה, זה ששולפים, נמדד המעקב התגלגלות בכוח נגד העקירה. המצע ואז מובאת בחזרה במגע עם הטיפ, עקבות מרגיעה נמדד איפה קיפול חלבונים יכול להיקבע מתוך העקירה כוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלב קריטי בפרוטוקול הוא השימוש polyprotein, שמתואר בשלב 1.1.2, אשר משמש פקד חיובי כדי “טביעות אצבע” אירועים מולקולה בודדת. באופן כללי, יש חייב להיות התגלגלות אירועים של החלבונים polyprotein (עבור I91, המשמעות היא כוח התגלגלות כ-200 pN, מתאר אורך קבועה של 28 ננומטר) למסקנה חד משמעית כי החלבון עניין כבר פרש. לדוגמ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית מענקים MCB-1244297 MCB-1517245 כדי PEM.
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
Riferimenti
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
- Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
- Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. . Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
- Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
- Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
- Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
- Davis, L. . Basic methods in molecular biology. , (2012).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
- Scholl, Z. N. . The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).
- Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
- . Nanopuller Available from: https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018)
- Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
- Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
- Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
- Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
- Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
- Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
- Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
- He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
- Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
- Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
- Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
- Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).
