Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop
Summary
Vi beskriver de detaljerede procedurer og strategier til at måle de mekaniske egenskaber og mekaniske udfoldelsen veje af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en atomic force mikroskop. Vi viser også repræsentative resultater som reference for valg af og begrundelse for god enkelt protein molekyle optagelser.
Abstract
Bestemmelse af de folde proces af proteiner fra deres aminosyresekvens til deres native 3D struktur er et vigtigt problem i biologi. Atomic force mikroskopi (AFM) kan løse dette problem ved at aktivere stretching og lempelse af enkelt proteinmolekyler, som giver direkte dokumentation for specifikke udfoldning og hvorved man genfolder karakteristika. AFM-baserede enkelt-molekyle kraft-spektroskopi (AFM-SMF’ER) giver mulighed for at måle konsekvent højenergi konformationer i proteiner, der ikke er muligt i traditionelle bulk (biokemiske) målinger. Skønt mange papirerne blev udgivet for at vise principper af AFM-SMF’ER, er det ikke let at udføre SMF’ER eksperimenter på grund af mangel på en udtømmende fuldstændig protokol. I denne undersøgelse, vi kort illustrerer principperne af AFM og detaljer omfattende protokoller, procedurer og analyse af data som en retningslinje til at opnå gode resultater fra SMF’ER eksperimenter. Vi demonstrere repræsentative SMF’ER resultater af enkelt protein mekaniske udfoldelsen målinger og vi leverer fejlfinding strategier for nogle almindeligt stødt på problemer.
Introduction
Fremskridt i enkelt molekyle kraft spektroskopi (SMF’ER) af AFM har aktiveret mekaniske manipulation og præcise karakterisering af enkelt proteinmolekyler. Denne Karakteristik har produceret nye indsigter om protein mekanik1,2, proteinfoldning3, protein-ligand interaktioner4, protein-protein interaktioner5, og protein-baserede manipuleret materialer6,7,8. SMF’ER er især nyttigt for at studere protein udspiller sig, som strækker sig af AFM tillader de kemiske og fysiske obligationer inden for protein molekyle gradvist udvide ifølge deres stivhed, som giver anledning til et stadigt stigende contour længde. Denne overstretching af et protein molekyle kan producere en brat overgang i kraft-udvidelse kurven resulterer i et brud begivenhed (eller tvinge peak). Force bjergtop giver direkte oplysninger om udfoldelsen kraft og strukturelle ændring af protein under den mekaniske udfoldelsen proces. En af de første undersøgelser ved hjælp af AFM målt titin1 og fundet nye aspekter af protein, udfoldning og hvorved man genfolder fysiologiske betingelser uden brug af unaturlige denatureringsmidler ligesom koncentreret kemikalier eller ekstreme temperaturer.
SMF’ER eksperimenter er udført på en bred vifte af instrumenter, men her mener vi kun AFM. AFM består af fire hovedelementer: sonden, detektoren, prøveholderen og den piezoelektriske scanner. Sonden er en skarp spids på en cantilever prægtig slutningen. Efter kalibrering, er bøjning af cantilever under udspænding af en vedhæftet molekyle målt ved hjælp af en laserstråle, der er reflekteres fra bagsiden af udlægget til netop afgøre styrker ved hjælp af Hookes lov. Afspejles laser stråle projekter i en kvadrant fotodiode detektor, som producerer en spænding i forhold til fordrivelse af laserstråle fra byens diode. Substratet med protein prøven i væske er monteret på en 3D piezoelektriske scene, der kan styres med sub nanometer præcision. En computer læser spændingen fra fotodiode detektorer og styrer den 3D scene gennem en computer-styrede spændingsforsyning. Disse piezo aktuator stadier er normalt udstyret med kapacitive eller stammen-gauge holdning sensorer til netop foranstaltning piezo deplacement og korrekte hysterese gennem feed-back control system. Sensor signaludgang fra piezo-controller er omdannet til afstand ved hjælp af konstanten spænding af piezo thats fabrik-kalibreret. Et eksempel force-udvidelsen kurve fra en trækker eksperiment er vist i figur 2.
Der er to typer af AFM-SMF’ER eksperimenter: konstant hastighed og konstant kraft trække målinger. Konstant kraft SMF’ER målinger er beskrevet i Oberhauser et al. 9, mens her vi fokuserer på konstant hastighed målinger. En typisk AFM konstant-velocity trækker eksperiment er udført af giver spænding til et piezo forsigtigt flytte et substrat i forhold til en cantilever tip. En typisk eksperiment har spidsen oprindeligt trykker mod overfladen. Den trækker måling er begyndt ved at flytte substrat fra spids til at bringe ud af kontakt. Hvis et protein, der kommer i kontakt med spids i første omgang, det vil blive trukket og udfoldelsen sporingen af magt mod fordrivelse vil blive målt. Underlaget er derefter bragt tilbage i kontakt med spidsen og en afslappende trace måles hvor proteinfoldning kan bestemmes fra force forskydning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et kritisk trin i protokollen er brugen af en polyprotein, beskrevet taktfast 1.1.2, der tjener som en positiv kontrol til “fingeraftryk” enkelt-molekyle begivenheder. Generelt, der skal udfoldelsen begivenheder af polyprotein proteiner (for I91, betyder det en udfoldelsen kraft af omkring 200 pN og kontur længde tilvækst af omkring 28 nm) til utvetydigt konkludere, at protein af interesse har været udfoldet. For eksempel, når protein af interesse er flankeret af tre I91 domæner fra begge sider, skal så der være m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation støtte MCB-1244297 og MCB-1517245 til PEM.
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
Riferimenti
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
- Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
- Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. . Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
- Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
- Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
- Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
- Davis, L. . Basic methods in molecular biology. , (2012).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
- Scholl, Z. N. . The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).
- Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
- . Nanopuller Available from: https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018)
- Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
- Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
- Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
- Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
- Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
- Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
- Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
- He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
- Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
- Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
- Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
- Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).
