Tvinge spektroskopi enkelt Protein molekyler med en Atomic Force mikroskopet
Summary
Vi beskriver detaljerte fremgangsmåter og strategier for å måle mekaniske egenskaper og mekanisk unfolding veier av enkelt protein molekyler med en atomic force mikroskop. Vi har også vise representant resultater som referanse for valg og justering av god enkelt protein molekyl innspillinger.
Abstract
Fastsettelse av folding proteiner fra deres aminosyresekvens til deres opprinnelige 3D struktur er viktig problem i biologi. Atomic force mikroskopi (AFM) kan løse dette problemet ved å aktivere strekking og avslapning av enkelt protein molekyler som gir direkte bevis av bestemte Utfolding og refolding egenskaper. AFM-baserte single-molekylet kraft-spektroskopi (AFM-SMFS) gir et middel til å måle konsekvent strømkrevende konformasjonen i proteiner som ikke er mulig i tradisjonell bulk (biokjemiske) mål. Selv om mange avhandlinger ble publisert for å vise prinsipper AFM-SMFS, er det ikke lett å utføre SMFS eksperimenter på grunn av en grundig komplett protokoll. I denne studien vi kort illustrere prinsippene i AFM og detalj mye protokoller, prosedyrer og dataanalyse som en retningslinje å oppnå gode resultater fra SMFS eksperimenter. Vi viser representant SMFS resultatene av enkelt protein mekanisk unfolding målinger og tilbyr feilsøking strategier for noen ofte støtt på problemer.
Introduction
Fremskritt innen ett molekyl force spektroskopi (SMFS) av AFM har aktivert mekanisk manipulasjon og presis karakterisering av enkelt protein molekyler. Denne karakteristikken har produsert romanen innsikt om protein mekanikk1,2, protein folding3, protein-ligand interaksjoner4, protein-protein interaksjoner5, og protein-basert utvikling materialer6,7,8. SMFS er spesielt nyttig for å studere protein utspiller seg, som strekker seg av AFM lar kjemiske og fysiske obligasjoner i protein molekylet gradvis utvide ifølge deres stivhet, som gir opphav til en stadig økende omkrets. Denne overstrekking av et protein molekyl kan produsere en brå overgang i kraft-utvidelse kurven som resulterer i en ruptur hendelse (eller tvinge topp). Force toppen gir direkte informasjon om unfolding styrke og strukturelle endringen av proteinet under mekanisk unfolding prosessen. En av de første studiene ved hjelp av AFM målt titin1 og fant romanen aspekter av protein Utfolding og refolding under fysiologiske forhold uten bruk av unaturlig denaturants som konsentrert kjemikalier eller ekstreme temperaturer.
SMFS eksperimenter er gjennomført på en rekke instrumenter, men her vi vurdere bare AFM. AFM består av fire hovedelementer: sonden, detektoren, prøve holderen og piezoelektrisk skanneren. Sonden er en skarp tips på den free-swinging enden av en cantilever. Etter kalibrering måles bøying hengende under strekking av en tilknyttet molekyl ved hjelp av en laserstråle som gjenspeiles av baksiden av hengende presist å avgjøre styrker med Hookes lov. Gjenspeiles laser strålen prosjektene i en kvadrant photodiode detektor som produserer en spenning til forskyvning av laserstrålen fra diode center. Underlaget med protein prøven i væske er montert på en 3D piezoelectric som kan kontrolleres med sub nanometer presisjon. En datamaskin leser spenningen fra de photodiode detektorer og styrer 3D scenen gjennom en datastyrt nettspenningen. Disse piezo aktuator faser er vanligvis utstyrt med kapasitive eller stamme-gauge posisjon sensorer å presist måle piezo forskyvning og riktig hysteresis gjennom tilbakemelding kontrollsystem. Sensor-utsignal fra piezo kontrolleren omdannes til avstand med konstant spenning av piezo som er kalibrert til fabrikken. En eksempel kraft-utvidelse kurve fra en trekke eksperiment er vist i figur 2.
Det finnes to typer AFM-SMFS eksperimenter: konstant hastighet og konstant kraft trekke målinger. Konstant kraft SMFS mål er beskrevet i Oberhauser et al. 9, mens her vi fokuserer på konstant hastighet målinger. En typisk AFM konstant hastighet trekke eksperiment gjøres ved å gi spenning til en piezo forsiktig flytte et substrat i forhold til en cantilever tips. En typisk eksperimentet har tipset først trykker mot overflaten. Trekke målingen er begynt ved å flytte underlaget fra spissen for å få ut av kontakten. Hvis et protein kommer i kontakt med spissen først, vil det bli trukket og unfolding spor av makt mot forskyvning vil bli målt. Underlaget er så brakt tilbake i kontakt med spissen og avslappende spor måles der proteinfolding kan bestemmes fra kraft forskyvning.
Protocol
Representative Results
Discussion
En avgjørende skritt i protokollen er bruken av en polyprotein, beskrevet i trinn 1.1.2, som fungerer som en positiv kontroll å “fingeravtrykk” single-molekylet hendelser. Generelt, det må være Utfolding hendelsene i polyprotein proteiner (for I91, betyr dette en unfolding kraft av ca 200 pN og kontur lengde økning av ca 28 nm) å entydig konkludere med at protein av interesse er brettet. For eksempel når protein av interesse er flankert av tre I91 domener fra hver side, være må det minst fire I91 arrangementer t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation tilskudd kalt MCB-1244297 og kalt MCB-1517245 til PEM.
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
Riferimenti
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
- Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
- Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. . Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
- Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
- Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
- Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
- Davis, L. . Basic methods in molecular biology. , (2012).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
- Scholl, Z. N. . The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).
- Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
- . Nanopuller Available from: https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018)
- Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
- Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
- Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
- Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
- Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
- Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
- Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
- He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
- Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
- Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
- Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
- Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).
