Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

Summary

Descrevemos os procedimentos detalhados e estratégias para medir as propriedades mecânicas e mecânicas vias desdobramento de moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica. Também mostramos resultados representativos como uma referência para a seleção e a justificativa de gravações de molécula de proteína única boa.

Abstract

A determinação do processo de dobramento de proteínas da sua sequência de aminoácidos para sua estrutura nativa 3D é um problema importante na biologia. Microscopia de força atômica (AFM) pode resolver este problema, permitindo o alongamento e relaxamento das moléculas de proteína único, que dá a evidência direta de desdobramento e dobrar características específicas. AFM-based single-força-espectroscopia molecular (AFM-SMFS) fornece um meio para medir consistentemente alta energia conformações em proteínas que não são possíveis em medições (Bioquímica) em massa tradicional. Embora numerosos foram publicados para mostrar os princípios de AFM-SMFS, não é fácil conduzir experimentos SMFS devido à falta de um protocolo completo exaustivamente. Neste estudo, podemos ilustrar brevemente os princípios da AFM e extensivamente detalham os protocolos, procedimentos e análise de dados como uma diretriz para alcançar bons resultados de experimentos SMFS. Podemos demonstrar resultados representativos de SMFS de medições de desdobramento mecânico só proteína e nós fornecemos a solução de estratégias para alguns comumente encontrado problemas.

Introduction

Avanços em espectroscopia de força única molécula (SMFS) por AFM permitiram a manipulação mecânica e caracterização precisa das moléculas de proteína única. Esta caracterização tem produzido novos insights sobre proteína mecânica^1,2, proteína³de dobramento, de interações proteína-ligante⁴de interações proteína-proteína⁵, e à base de proteínas engenharia materiais de^7,6,8. SMFS é especialmente útil para estudar proteínas desdobramentos, como alongamento por AFM permite que as ligações químicas e físicas dentro da molécula de proteína para estender gradualmente de acordo com a sua rigidez, que dá origem a um comprimento de contorno continuamente crescente. Esta distensão excessiva de uma molécula de proteína pode produzir uma transição abrupta na curva força-extensão, resultando em um evento de ruptura (ou forçar o pico). O pico de força dá informações directas sobre a mudança de força e estrutural desdobramento da proteína durante o processo de desdobramento mecânico. Um dos primeiros estudos usando AFM medido Titina¹ e encontrou novos aspectos da proteína desdobramento e dobrar sob condições fisiológicas, sem o uso de desnaturantes não naturais como produtos químicos concentrados ou temperaturas extremas.

SMFS experimentos são realizados em uma variedade de instrumentos, embora aqui consideramos apenas o AFM. O AFM é composto de quatro elementos principais: a sonda, o detector, o titular da amostra e o scanner piezoelétrico. A sonda é uma ponta afiada na extremidade especulava de um cantilever. Após a calibração, dobra do cantilever durante o alongamento de uma molécula anexada é medido utilizando um feixe de laser que é refletido na parte de trás do cantilever para determinar precisamente as forças usando a lei de Hooke. Os projetos do feixe do laser refletida em um detetor de fotodiodo quadrante que produz uma tensão proporcional ao deslocamento do feixe de laser do centro de diodo. O substrato com a amostra de proteína no líquido é montado sobre um palco piezoelétrico 3D que pode ser controlado com precisão de nanômetros sub. Um computador lê a tensão de detectores fotodiodo e controla o palco 3D através de uma fonte de tensão controlada por computador. Estes estágios de atuador piezo geralmente são equipados com capacitivo ou calibre de tensão-sensores de posição para deslocamento de piezo precisamente medida e histerese correta através do sistema de controle de feedback. A saída de sinal do sensor do controlador piezo é convertida em distância usando a constante tensão do piezo é calibrado de fábrica. Uma curva de força-extensão do exemplo de uma experiência de puxar é mostrada na Figura 2.

Existem dois tipos de experimentos de AFM-SMFS: velocidade constante e a constante força puxando as medições. Medições de força constante SMFS são descritas em Oberhauser et al ⁹, enquanto aqui focamos em medições de velocidade constante. Um experimento típico de puxando de velocidade constante em AFM é feito fornecendo tensão para um piezo para mover suavemente um substrato em relação a dica do cantilever. Um experimento típico tem a ponta inicialmente pressionando contra a superfície. A medição puxa é começada, movendo o substrato longe a ponta de contato. Se uma proteína entra em contato com a ponta inicialmente, ele será puxado e o rastreamento de desdobramento da força contra deslocamento será medido. O substrato é então trazido de volta em contacto com a ponta e um relaxante rastreamento é medido onde enrolamento de proteínas pode ser determinada a partir do deslocamento de força.

Protocol

1. a proteína preparação Clonagem de DNA. Sintetizar uma sequência de DNA de interesse, por exemplo, a sequência de DNA de NI10C10, ou isolar através do PCR do organismo hospedeiro usando padrão biologia molecular técnicas11. Flanqueiam o gene de interesse, com sites de restrição durante a síntese ou colocando sites na extremidade 5′-dos primers PCR para corresponder a um módulo em pEMI91 o plasmídeo (Addgene #74888)<sup cl…

Representative Results

Resultados representativos do presente protocolo são mostrados na Figura 2. Ambos os painéis mostram curvas força-extensão representativa das proteínas. A parte superior mostra os resultados uma poliproteína I91, enquanto a parte inferior mostra a proteína I91 flanqueando um proteína de interesse, a molécula de10C NI. Estas gravações mostram o vigor característico do I91 (200 pN) e contorne o incremento de comprimento (28 nm) que indica…

Discussion

Um passo crítico no protocolo é a utilização de uma poliproteína, descrita na etapa 1.1.2, que serve como um controle positivo de “impressões digitais” single-molécula eventos. Geralmente, deve ser desdobramento eventos das proteínas poliproteína (para I91, isso significa uma força de desdobramento de cerca de 200 pN e contorno incremento de comprimento de cerca de 28 nm) para concluir inequivocamente que a proteína de interesse tem sido desdobrada. Por exemplo, quando a proteína de interesse é flanqueada po…

Materials

AFM Specimen Discs, 15mm diameter	Ted Pella, Inc.	16218	Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick	Ted Pella, Inc.	26024	serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs	Ted Pella, Inc.	16079	Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly	Bruker Nano Inc.	1B75C	AFM head
Glass probe holder	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.
Microlever AFM probes	Bruker Nano Inc.	MLCT	Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips	Bruker Nano Inc.	OBL-10	Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs	National Instruments	PCI-6259	Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators	Physik Instrumente LP	P-753.11C	Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface