Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop
Summary
Vi beskriver detaljerade förfaranden och strategier att mäta mekaniska egenskaper och mekaniska utspelas vägar av enda proteinmolekyler genom en atomic force Mikroskop. Vi visar också representativa resultat som en referens för urval och motivering av bra enda protein molekyl inspelningar.
Abstract
Bestämning av fällbara processen av proteiner från deras aminosyrasekvens till deras infödda 3D-strukturen är ett viktigt problem i biologi. Atomic force microscopy (AFM) kan lösa problemet genom att aktivera stretching och avslappning av enda proteinmolekyler, som ger direkta bevis för specifika utspelar sig och vika egenskaper. AFM-baserade single-molekyl kraft-spektroskopi (AFM-SMFS) tillhandahåller ett sätt att mäta konsekvent high-energy konformationer i proteiner som inte är möjligt i traditionell bulk (biokemiska) mätningar. Även om många papper publicerades för att visa principer för AFM-SMFS, är det inte lätt att genomföra SMFS experiment på grund av ett uttömmande komplett protokoll. I denna studie vi kortfattat illustrera principerna för AFM och detalj omfattande om protokoll, förfaranden och dataanalys som riktlinje att uppnå goda resultat från SMFS experiment. Vi visar representativa SMFS resultat av enda protein mekaniska pågående mätningar och vi tillhandahåller felsökningsstrategier för vissa ofta stött på problem.
Introduction
Framsteg inom enda molekyl kraft spektroskopi (SMFS) av AFM har aktiverat mekanisk manipulation och exakt karakterisering av enda proteinmolekyler. Denna karakterisering har producerat nya insikter om protein mekanik1,2, protein fällbara3, protein-ligand interaktioner4, protein-protein interaktioner5, och protein-baserade konstruerad material6,7,8. SMFS är särskilt användbart för att studera protein utspelar sig, som stretching av AFM tillåter de kemiska och fysiska obligationerna inom proteinmolekyl att gradvis utvidga enligt deras stelhet, som ger upphov till en ständigt ökande kontur längd. Detta översträckning av en proteinmolekyl kan producera en abrupt övergång i kraft-extension kurvan vilket resulterar i en bristning-händelse (eller tvinga peak). Kraft toppen ger direkt information om utspelas kraft och strukturella förändringen av protein under processen mekaniska utspelas. En av de första studierna använder AFM mätt titin1 och hittade nya aspekter av protein utspelar sig och vika under fysiologiska betingelser utan användning av onaturliga denatureringsmedel som koncentrerade kemikalier eller extrema temperaturer.
SMFS experiment utförs på olika instrument, även här anser vi bara AFM. AFM består av fyra huvuddelar: sonden, detektorn, provhållaren och piezoelektriska skannern. Sonden är en vass spets domkyrkoklockan ände en fribärande. Efter kalibrering mäts böjning av uthänget under stretching av en bifogade molekyl med hjälp av en laserstråle som återspeglas på baksidan av uthänget att exakt bestämma styrkor med Hookes lag. Återspeglas laser beam projekt i en kvadrant fotodiod detektor som producerar en spänning i proportion till förskjutningen av laserstrålen från stadens diod. Underlaget med protein provet i vätska är monterad på en 3D piezoelektriska scenen som kan styras med sub nanometer precision. En dator läser spänningen från fotodiod detektorerna och styr 3D scenen genom en datorstyrd spänningstillförsel. Dessa piezo actuator stadier är vanligtvis utrustade med kapacitiv eller stam-gauge ståndpunkt sensorer att exakt mäta piezo förskjutning och rätt hysteres genom återkoppling styrsystem. Sensor signal utdata från piezo handkontrollen omvandlas till avstånd med konstanten spänning av den piezo som är fabriken-kalibrerad. En exempel kraft-extension kurva från en dragande experiment visas i figur 2.
Det finns två typer av AFM-SMFS experiment: konstant hastighet och konstant kraft dra mätningar. Konstant kraft SMFS mätningar beskrivs i Oberhauser o.a. 9, medan här fokuserar vi på konstant hastighet mätningar. En typisk AFM konstant hastighet dragkraft experiment görs genom att ge spänning till en piezo att försiktigt flytta ett substrat i förhållande till en fribärande spets. En typisk experiment har spetsen först trycka mot ytan. Dra mätningen påbörjas genom att flytta substratet från spetsen att föra ut ur kontakten. Om ett protein som kommer i kontakt med spets från början, det kommer att dras och utspelas tracen av kraft mot förskjutning kommer att mätas. Substratet förs sedan tillbaka i kontakt med spets och en avkopplande trace mäts där proteinveckning kan fastställas från kraft förskjutningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett avgörande steg i protokollet är att utnyttja ett polyprotein, beskrivs i steg 1.1.2, som fungerar som en positiv kontroll till ”fingeravtryck” singel-molekyl händelser. Generellt, det måste utspelas händelser av polyprotein proteiner (I91, innebär detta en utspelas styrka av ca 200 pN och kontur längd ökning av ca 28 nm) entydigt dra slutsatsen att proteinet av intresse har varit Övik. Till exempel när proteinet av intresse ligger flankerad av tre I91 domäner från endera sidan, måste då man minst fy…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Science Foundation bidrag MCB-1244297 och MCB-1517245 till PEM.
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
Riferimenti
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
- Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
- Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. . Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
- Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
- Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
- Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
- Davis, L. . Basic methods in molecular biology. , (2012).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
- Scholl, Z. N. . The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).
- Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
- . Nanopuller Available from: https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018)
- Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
- Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
- Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
- Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
- Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
- Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
- Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
- He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
- Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
- Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
- Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
- Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).
