Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas
Summary
Este manuscrito apresenta métodos para a Análise morfométrica e as mudanças celulares dentro do côndilo mandibular de roedores.
Abstract
Articulação temporomandibular (ATM) tem a capacidade de adaptação a estímulos externos, e carregar as alterações pode afetar a posição dos côndilos, bem como os componentes estruturais e celulares da cartilagem condilar mandibular (MCC). Este manuscrito descreve métodos para analisar estas mudanças e um método para alterar o carregamento da TMJ em camundongos (i.e., à compressão estática TMJ carregando). A avaliação estrutural ilustrada aqui é uma abordagem simples morfométricos que usa o software Digimizer e é executada em radiografias de ossos pequenos. Além disso, a análise de celulares muda levando a alterações na expressão do colágeno, a remodelação óssea, a divisão celular, e proteoglycan distribuição no MCC é descrita. A quantificação dessas mudanças em cortes histológicos – contando os pixels fluorescentes positivos usando imagem de software e o mapeamento de distância de medição e manchado área com Digimizer – também é demonstrado. Os métodos mostrados aqui não são limitados a TMJ murino, mas podem ser usados em ossos adicionais de pequenos animais experimentais e em outras regiões de ossificação endocondral.
Introduction
A TMJ é uma articulação de carga exclusiva localizada na região craniofacial e é formada de fibrocartilagem. O MCC da TMJ é essencial para a função da articulação, incluindo o movimento da mandíbula sem impedimentos ao falar e mastigar, mas geralmente é afetado por doenças degenerativas, incluindo osteoartrite1. A TMJ tem a capacidade de adaptação a estímulos externos e alterações de carga, levando a alterações estruturais e celulares para os componentes do MCC2,3,4,5. As propriedades de carga do MCC podem ser explicadas pelas interações entre seus componentes, incluindo a água, a rede de colágeno e densamente proteoglicanos. O MCC tem quatro zonas distintas de celulares que expressam diferentes tipos de proteínas de colágeno e não-colágeno: 1) a zona superficial ou articular; 2) a zona proliferativa, composta de células mesenquimais indiferenciadas e que responde ao carregar as demandas; 3) a zona de prehypertrophic, composto de condrócitos maduros expressando colágeno tipo 2; e 4) a hipertrófica de zona, a região onde os condrócitos hipertróficas expressando colágeno tipo 10 morrer e sofrer calcificação. A região não-mineralizado é rica em proteoglicanos que proporcionam resistência a forças compressivas6.
Há contínua mineralização na zona hipertrófica do MCC, onde ocorre a transição da condrogênese a osteogênese, garantindo a robusta estrutura mineral do osso subcondral do côndilo mandibular7. As mudanças celulares em regiões não mineralizadas e mineralizadas, finalmente, levam a alterações morfológicas e estruturais no côndilo mandibular e maxilar inferior. Manutenção da homeostase de todas as regiões celulares do MCC e a mineralização da parte subcondral são essenciais para a saúde, capacidade load-bearing e integridade da TMJ.
O modelo de rato transgénico colágeno múltipla (como descrito por Utreja et al) 8 é uma ótima ferramenta para usar para entender mudanças na expressão do colágeno, porque todos os transgenes são expressas em MCC. Para uma avaliação aprofundada e histológica, manchas histológicas são utilizadas para estudar a deposição de matriz, mineralização, proliferação celular, apoptose, e expressão de proteínas para as camadas de células diferentes do MCC.
Neste manuscrito, histológico e análises morfométricas são usadas para avaliar as alterações estruturais e celulares no MCC e subcondral osso do côndilo mandibular de ratos. Além disso, um método de quantificação de célula, para a análise de imagens histológicas fluorescentes e para mapear as corrediças do microscópio de luz, é descrito. A TMJ estática à compressão carregando o método, que provoca alterações celulares e morfológicas na MCC e subcondral osso9, também é ilustrada para validar nossos métodos.
Os métodos descritos aqui podem ser usados para determinar morfométricos e as alterações histológicas no côndilo mandibular e maxilar inferior de roedores ou para analisar outras regiões de ossificação endocondral e a morfologia dos tecidos mineralizados adicionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito descreve métodos para a medição de morfometria e análise celular dos côndilos mandibulares murino e mandíbulas. As medições radiográficas morfométricas também podem ser usadas para analisar outros ossos de pequenos animais experimentais. Além disso, a análise celular (célula quantificação e mapeamento de distância de cartilagem) não estão limitada a do côndilo mandibular roedor, mas pode ser usado para quantificar a cortes histológicos de tecidos diversos.
…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer Dr. David Rowe para gentilmente fornecer os ratos transgénicos e Li Chen pela assistência histológica.
A pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Dental & pesquisa Craniofacial do institutos nacionais da saúde sob prêmio número K08DE025914 e pela Associação Americana de fundação ortodôntico para Sumit Yadav.
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
Riferimenti
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