Морфометрические и клеточного анализа метод для мышиных нижней челюсти мыщелка
Summary
Эта рукопись представляет методы для анализа морфометрических и клеточные изменения в пределах нижней челюсти мыщелка грызунов.
Abstract
Височно-нижнечелюстного сустава (ВНЧС) имеет способность адаптироваться к внешним воздействиям, и загрузки изменения могут повлиять на позицию мыщелок, а также структурные и клеточные компоненты нижнечелюстной мыщелкового хряща (MCC). Эта рукопись описывает методы для анализа этих изменений и метод для изменения загрузки ВНЧС мышей (т.е., при сжатии статического ВНЧС загрузки). Структурной оценки, показанные здесь является простой морфометрические подход, который использует программное обеспечение Digimizer и выполняется в рентгенограммы мелких костей. Кроме того анализ сотовых изменения ведущие к изменениям в выражение коллагена, костного ремоделирования, деление клеток, и описан протеогликана распределения в MCC. Количественная оценка этих изменений в гистологических срезах – подсчитывая позитивные флуоресцентные пикселей с помощью программного обеспечения и измерения расстояния отображение изображений и окрашенных области с Digimizer – также продемонстрировал. Методы, показанный здесь, не ограничиваются мышиных височно-нижнечелюстного сустава, но могут быть использованы дополнительные кости небольших экспериментальных животных и в других регионах endochondral окостенения.
Introduction
ВНЧС является уникальный несущие сустава, расположен в регионе краниофациальных и формируется костная. MCC ВНЧС имеет важное значение для функции сустава, включая движение беспрепятственный челюсти а masticating, выступая, но часто подвержена дегенеративные заболевания, включая1остеоартрита. ВНЧС имеет способность адаптироваться к внешние раздражители и загрузки изменений, ведущих к структурной и клеточные изменения компонентов MCC2,3,,45. Свойства несущих МСС можно объяснить взаимодействие между его составляющих, включая воду, коллагена сети и плотно упакованные протеогликаны. MCC имеет четыре различных клеточных зонах, которые выражают различные типы белков коллагена и не коллаген: 1) поверхностные или суставной зоны; 2) пролиферативную зоны, состоящий из недифференцированных мезенхимальных клеток и что отвечает на загрузку требования; 3 prehypertrophic зона, состоящая из зрелых хондроцитов, выражая коллаген типа 2; и 4) гипертрофических зона, регионе, где гипертрофических хондроцитов, выражая коллаген типа 10 умирают и пройти кальцификации. Минерализованных регион богат протеогликаны, которые обеспечивают устойчивость к сжимающей силы6.
Существует непрерывная минерализации в зоне гипертрофических MCC, где происходит переход от chondrogenesis к остеогенез, гарантируя надежную минерального состава субхондральной кости нижней челюсти мыщелка7. Клеточные изменения в районах unmineralized и минерализованных в конечном итоге привести к морфологических и структурных изменений в нижней челюсти мыщелка и нижней челюсти. Поддержание гомеостаза всех клеточных регионов MCC и минерализации в субхондральной части имеют важное значение для здоровья, несущая способность и целостности ВНЧС.
Несколько модель трансгенные мыши коллагена (как описано в Утега и др.) 8 представляет собой прекрасный инструмент для использования понять изменения в выражении коллагена, потому что все трансгенов выражаются в MCC. Для углубленной оценки гистологических гистологические пятна используются для изучения матрицы осаждения, минерализации, пролиферации клеток и апоптоз, а также выражения протеина в различных клеточных слоев MCC.
В этой рукописи, гистологические и морфометрического анализа используются для оценки сотовой и структурные изменения в MCC и субхондральной кости нижней челюсти мыщелка мышей. Кроме того описан метод количественной оценки клетки, для анализа флуоресцентные гистологические изображения и для отображения световой микроскоп слайды. При сжатии статического ВНЧС, загрузки метод, который вызывает сотовой и морфологические изменения в MCC и субхондральной кости9, также иллюстрируется для проверки наших методов.
Методы, описанные здесь может использоваться для определения морфометрических и гистологические изменения в нижней челюсти мыщелка и нижняя челюсть грызунов или для анализа других регионов endochondral окостенения и морфология дополнительных минерализованных тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта рукопись описал методы морфометрические измерения и клеточного анализа мышиных нижнечелюстной мыщелков и мандибулы. Радиографические морфометрические измерения может также использоваться для анализа других костей от небольших экспериментальных животных. Кроме того клеточного…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Дэвид Роув за любезно предоставленную трансгенных мышей и Li-Chen для гистологической помощи.
Исследования в этой публикации было поддержано Национального Института стоматологии и челюстно-лицевой исследования национальных институтов здоровья под награду номер K08DE025914 и Американской ассоциации ортодонтические фондом для Sumit Yadav.
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
Riferimenti
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
- Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
- Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
- Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599 (2016).
- Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
- Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121 (2016).
- Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468 (2016).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
- Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
