En morfometriska och cellulära analysmetod för murina Mandibular Condyle
Summary
Detta manuskript presenterar metoder för att analysera morfometriska och cellulära förändringar inom den mandibular condylen av gnagare.
Abstract
Käkleden (TMJ) har kapacitet att anpassa sig till yttre stimuli, och laddar ändringar kan påverka placeringen av kondyler, liksom de strukturella och cellulära komponenterna av mandibular kondylärt brosk (MCC). Detta manuskript beskrivs metoder för att analysera dessa förändringar och en metod för att ändra lastning av TMJ i möss (dvs tryckkraft statiska TMJ laddar). Strukturella utvärderingen illustreras här är en enkel morfometriska metod som använder programvaran Digimizer och utförs i röntgenbilder av små ben. Dessutom, analys av cellulära förändringar leder till förändringar i kollagen uttryck, benremodellering, celldelning och proteoglykan distribution i MCC beskrivs. Kvantifiering av dessa förändringar i histologiska avsnitt – genom att räkna de positiva fluorescerande pixlar med bild programvara och mäta avståndet mappningen och färgade området med Digimizer – demonstreras också. De metoder som visas här är inte begränsade till murina TMJ, men kan användas på ytterligare ben av små experimentella djur och i andra regioner i endochondral benbildning.
Introduction
TMJ är en unik bärande gemensamt i regionen kraniofaciala och bildas av fibrocartilage. MCC av TMJ är nödvändigt för ledfunktion, inklusive obehindrat käken rörelse samtidigt tala och masticating, men den påverkas ofta av degenerativa sjukdomar, inklusive artros1. TMJ har kapacitet att anpassa sig till yttre stimuli och lastning förändringar, vilket leder till strukturella och cellulära förändringar till komponenterna i MCC2,3,4,5. MCC-bärande egenskaper kan förklaras av interaktioner mellan dess beståndsdelar, inklusive vatten, kollagen nätverket, och tätt packade proteoglykaner. Den MCC har fyra distinkta cellulära zoner som uttrycka olika typer av kollagen och icke-kollagen proteiner: 1) ytlig eller artikulära zonen; (2) proliferativ zonen består av odifferentierade mesenkymala celler och som svarar på lastning krav; (3) den prehypertrophic zonen, består av mogen kondrocyter uttrycker kollagen typ 2; och 4) den hypertrofisk zonen, regionen där hypertrofisk kondrocyterna att uttrycka kollagen typ 10 dö och genomgå förkalkning. Icke-mineraliserad regionen är rik på proteoglykaner som ger resistens mot tryckkraft styrkor6.
Det finns kontinuerlig mineralisering vid zonen hypertrofisk MCC, där övergången från kondrogenes till osteogenesis uppstår, garanterar det subkondrala benet av mandibular condyle7robust mineral struktur. Cellförändringar i regionerna unmineralized och mineraliserade slutligen leda till morfologiska och strukturella förändringar i mandibular condyle och underkäken. Underhåll av homeostas av alla cellulära regioner MCC och mineraliseringen av subkondrala portion är nödvändiga till hälsa, bärförmåga och integritet TMJ.
Flera kollagen transgen musmodell (som beskrivs av Utreja et al.) 8 är ett bra verktyg att använda för att förstå förändringar i kollagen uttryck eftersom alla transgener uttrycks i MCC. För en fördjupad histologisk utvärdering används histologiska fläckar att studera matrisen nedfall, mineralisering, cellproliferation, apoptos, samt och proteinuttryck på de olika cellagren MCC.
I detta används manuskript, histologiska och morfometriska analyser för att utvärdera cellulära och strukturella förändringar i MCC och subkondrala benet av mandibular condyle av möss. Dessutom beskrivs en cell kvantifiering metod, för att analysera fluorescerande histologiska bilder och för kartläggning av ljusmikroskop diabilder. Tryckkraft statiska TMJ lastning metod, vilket gör cellulära och morfologiska förändringar vid MCC och subkondrala benet9, illustreras också för att validera våra metoder.
Metoderna som beskrivs här kan användas för att bestämma morfometriska och histologiska förändringar i mandibular condyle och underkäken gnagare eller att analysera andra regioner i endochondral benbildning och morfologi av ytterligare mineraliserade vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta manuskript beskrivs metoder för morfometriska mätning och cellulära analyser av murina mandibular kondyler och Underkäkar. Radiografisk morfometriska mätningarna kan också användas för att analysera andra ben från små experimentella djur. Dessutom den cellulära analysen (cell kvantifiering och brosk avstånd mappning) är inte begränsade till gnagare mandibular condyle, men kan användas för att kvantifiera histologiska sektioner i många vävnader.
Transgena musmodeller utt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr David Rowe för vänligt att ge de transgena möss och Li Chen för histologiska hjälp.
Den forskning som redovisas i denna publikation stöddes av det nationella institutet för Dental & kraniofaciala forskning av det nationella Institutes of Health under Award nummer K08DE025914 och av den amerikanska Association av ortodontiska Foundation till Sumit Yadav.
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
Riferimenti
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
- Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
- Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
- Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599 (2016).
- Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
- Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121 (2016).
- Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468 (2016).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
- Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
