الكشف عن الخلايا السلف محمر المانحة المتبقية بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم للمرضى الذين يعانون من هيموجلوبينوباثيس
Summary
مطلوب التقدير الكمي للخلايا المستمدة من الجهات المانحة لرصد engraftment بعد زرع الخلايا الجذعية في المرضى الذين يعانون من هيموجلوبينوباثيس. مزيجاً من التدفق الخلوي تقوم الخلية الفرز والمقايسة تشكيل مستعمرة والتحليل اللاحق للترادف قصيرة يكرر يمكن استخدامها لتقييم انتشار والتفريق بين فروعه في حجرة محمر.
Abstract
ويلاحظ وجود تشيميريسم غير مكتملة في نسبة كبيرة من المرضى بعد زرع نخاع العظم الثلاسيميا الكبرى أو مرض الخلية المنجلية. وهذه الملاحظة آثار هائلة، كما يمكن تحسين استراتيجيات المرباة العلاجية اللاحقة النتائج السريرية. تقليديا، يستخدم تحليل يستند إلى سلسلة من ردود الفعل بوليميريز ليكرر قصيرة جنبا إلى جنب لتحديد تشيميريسم في خلايا الدم المستمدة من الجهات المانحة. بيد أن هذا الأسلوب يقتصر على الخلايا المنواه ولا يميز بين الأنساب خلية واحدة معزولة. ونحن تطبيق تحليل يكرر قصيرة جنبا إلى جنب لتدفق الخلايا السلف المكونة للدم سيتوميتريك فرز ومقارنة ذلك مع تحليل يكرر قصيرة جنبا إلى جنب التي تم الحصول عليها من وحدة تشكيل انفجر مختارة-المستعمرات محمر، سواء التي تم جمعها من العظم نخاع. بهذه الطريقة نحن قادرون على إثبات انتشار مختلفة والتفريق بين الخلايا المانحة في حجرة محمر. هذا الأسلوب مؤهلاً لاستكمال الرصد الحالية من تشيميريسم في زرع الخلايا الجذعية الإعداد وبالتالي قد تكون الدراسات السريرية في المستقبل التطبيقية وأبحاث الخلايا الجذعية وتصميم تجارب العلاج بالجينات.
Introduction
زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم متمكنة (هسكت) هو النهج العلاجية متوفرة فقط لمجموعة متنوعة من الاضطرابات الوراثية فطرية للنظام المكونة للدم، وتحقيق معدلات البقاء خالية من المرض لأكثر من 90% لالا شديدة الخطر و 1من المرضى الحياة محدودة. وقد تم تحسين فعالية هذه الأداة العلاجية الهامة عن طريق الحد من سمية قبل-وبعد زرع الأنظمة العلاجية2، ولكن أيضا من التدخلات الرامية إلى الحفاظ على وظيفة مستقرة الفساد، الذي هو كمياً بالرصد الدقيق ل الخلايا المستمدة من المانحين3،،من45.
بشكل عام، تشيميريسم كاملة (CC) يعني استبدال مجموع من حجرة ليمفوهيماتوبويتيك بالخلايا المستمدة من الجهات المانحة، في حين يستخدم مصطلح مختلطة تشيميريسم (MC) عندما تكون الخلايا المستمدة من الجهات المانحة والمستفيدة الحالية في وقت واحد في مختلف نسب. تقسيم تشيميريسم (SC) يدل على التعايش بين تشيميريسم المختلطة التي لوحظت في الأنساب خلية واحدة، كما هو الحال في حجرة محمر. سرعة البت في وضع تشيميريسم عقب هسكت أمر بالغ الأهمية، كما أنها قد تساعد في تحديد المرضى عرضه للانتكاس المرض واستراتيجيات immunomodulatory اللاحقة بدء، مثل المانحين اللمفاويات دفعات أو الحد من كآبته 6من العلاجات.
وقد وضعت عدة أساليب لرصد engraftment بعد هسكت. إيسوتيبينج المناعية وتحليل cytogenetics حساسية فقيرة ومحدودة من حيث قدرتها على الكشف عن تعدد الأشكال7،8. الأخذ بتهجين الفلورسنت في الموقع (الأسماك) يمكن تعزيز الحساسية في رصد تشيميريسم بعد هسكت، ولكن يقتصر على الجنس متطابقة اللوجرافتس9. في الوقت الراهن، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو الأسلوب الأكثر انتشارا المستخدمة للكشف عن تشيميريسم، وهو يستند إلى التقليدية [اغروس]-الاكريلاميد جل التفريد ليكرر جنبا إلى جنب رقم متغير (فنترس) أو تكرار قصيرة جنبا إلى جنب (المشبوهة). تستخدم بشكل روتيني PCR الكمي قادراً على الكشف عن نسبة ضئيلة للغاية من خلايا المانحين المتبقية بعد هسكت. القيد الرئيسي للدراسات حتى الآن هو أن الكشف MC يكاد يقتصر على وجود الخلايا المنواه، بدلاً من الكريات الحمراء الناضجة، إلا وهي الخلايا أن وظيفيا حاسمة بالنسبة للمرضى الذين يتأثرون هيموجلوبينوباثيس. في المرضى الذين يعانون من مختلف فصائل الدم، فإنه يجدر بنا أن نتذكر أن التحليل سيتوفلوروميتريك غير قادرة على تحديد تشيميريسم في خلايا الدم الحمراء باستخدام الأجسام المضادة الموجهة نحو المستضدات كرات الدم الحمراء أبو وج، ج، د، ه، وه10 , 11-وسائل مختلفة، ولكن مثيرة جداً للاهتمام لتقييم تشيميريسم في النسب محمر هو المزيج من تدفق سيتوميتريك فرز موروث محمر ومختارة من مختلف أنواع السلف محمر باستزراع في فحوصات كلونوجينيك، يتبع بتحليل لشارع12. هذا النهج قادرة على قياس الارتفاع النسبي للمانح-مقابل-المتلقي تشيميريسم في حجرة محمر ويمكن استخدامها في الاستراتيجية الرامية إلى إدامة الفساد نخاع العظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهدف الدراسة الحالية تقديم مزيج من النهجين الجمهور لتحليل تشيميريسم الجهات المانحة والمتلقية في فروعه محمر بعد هسكت في المرضى علاج هيموجلوبينوباثيس: 1.) الأسفار تنشيط الخلية الفرز خلايا السلف المكونة للدم في عينات نخاع العظم متبوعاً بتحليل ليكرر قصيرة جنبا إلى جنب و 2). وحدة تشكيل مستعمرة …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل Südtirol ريجينبوجين كينديركريبشيلفي.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
Riferimenti
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
