दाता के ठहराव-व्युत्पन्न कोशिकाओं hemoglobinopathies के साथ रोगियों में स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के बाद engraftment पर नजर रखने के लिए आवश्यक है. प्रवाह cytometry का एक संयोजन आधारित सेल छंटाई, कॉलोनी गठन परख, और लघु मिलकर दोहराता के बाद के विश्लेषण के प्रसार और erythroid डिब्बे में progenitors के भेदभाव का आकलन किया जा सकता है ।
अपूर्ण chimerism की उपस्थिति thalassemia प्रमुख या सिकल सेल रोग के लिए अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद रोगियों के एक बड़े अनुपात में उल्लेख किया है । इस अवलोकन जबरदस्त निहितार्थ है, के रूप में बाद में चिकित्सीय चुहियों रणनीतियों नैदानिक परिणाम में सुधार कर सकते हैं । पारंपरिक, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया-लघु मिलकर दोहराया के विश्लेषण के आधार पर दाता में chimerism की पहचान रक्त कोशिकाओं को प्राप्त किया जाता है । हालांकि, इस विधि nucleated कक्षों के लिए प्रतिबंधित है और असंबद्ध एकल-कक्ष वंश के बीच भेद नहीं कर सकता । हम लघु मिलकर दोहराता के विश्लेषण के लिए cytometric-टेम जनक कोशिकाओं के प्रवाह को लागू किया और लघु मिलकर चुना फट इकाई-erythroid कालोनियों, दोनों की हड्डी से एकत्र से प्राप्त दोहराता के विश्लेषण के साथ तुलना मज्जा. इस विधि के साथ हम erythroid डिब्बे में विभिंन प्रसार और दाता कोशिकाओं के भेदभाव का प्रदर्शन कर रहे हैं । यह तकनीक स्टेम सेल प्रत्यारोपण की स्थापना में chimerism की वर्तमान निगरानी को पूरा करने के लिए पात्र है और इस प्रकार भविष्य नैदानिक अध्ययन में लागू किया जा सकता है, स्टेम सेल अनुसंधान और जीन चिकित्सा परीक्षणों के डिजाइन ।
Allogeneic टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (HSCT) टेम प्रणाली के अजन्मे आनुवंशिक विकारों की एक किस्म के लिए ही उपलब्ध उपचारात्मक दृष्टिकोण है, अंयथा अत्यधिक समझौता और के लिए ९०% से अधिक की बीमारी मुक्त जीवित रहने की दर को प्राप्त करने जीवन सीमित रोगियों1. इस महत्वपूर्ण चिकित्सीय उपकरण की प्रभावकारिता पूर्व और बाद प्रत्यारोपण परहेजों की विषाक्तता को सीमित द्वारा अनुकूलित किया गया है2, लेकिन यह भी स्थिर भ्रष्टाचार समारोह, जो की करीब निगरानी द्वारा मात्रा है बनाए रखने के उद्देश्य से हस्तक्षेप द्वारा दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं3,4,5.
सामांय में, पूर्ण chimerism (CC) दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं द्वारा lymphohematopoietic डिब्बे की कुल प्रतिस्थापन का तात्पर्य है, जबकि मिश्रित chimerism (MC) का प्रयोग तब किया जाता है जब दाता-और प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न कोशिकाएं एक साथ विभिंन अनुपात. स्प्लिट chimerism (SC), एकल-कक्ष वंश में स्वीकार्य मिश्रित chimerism के सह-अस्तित्व को नोट करता है, जैसे erythroid डिब्बे में । chimerism स्थिति का शीघ्र निर्धारण HSCT के बाद महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह रोग पतन के लिए अतिसंवेदनशील रोगियों की पहचान और दाता लिम्फोसाइट सुई लेनी या गुर्दे की कमी के रूप में बाद में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी रणनीतियों, आरंभ करने में मदद कर सकते है 6चिकित्सा ।
HSCT के बाद engraftment की निगरानी के लिए कई विधियाँ विकसित की गई हैं. इम्युनोग्लोबुलिन और cytogenetics के विश्लेषण के Isotyping गरीब संवेदनशीलता है और बहुरूपता7,8का पता लगाने की क्षमता में सीमित हैं । सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट की शुरूआत HSCT के बाद chimerism की निगरानी में संवेदनशीलता को बढ़ा सकती है, लेकिन सेक्स-बेमेल allografts9तक ही सीमित है । वर्तमान में, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) सबसे व्यापक chimerism का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया विधि है और पारंपरिक agarose पर आधारित है acrylamide जेल ट्रो के चर संख्या मिलकर दोहराता है (VNTRs) या कम मिलकर दोहराता है (STRs) । नियमित रूप से इस्तेमाल मात्रात्मक पीसीआर HSCT निंनलिखित अवशिष्ट दाता कोशिकाओं के एक अत्यंत छोटे अनुपात का पता लगाने में सक्षम है । अध्ययन की अब तक की प्रमुख सीमा है कि MC पता लगाने लगभग अनंय रूप से nucleated कोशिकाओं की उपस्थिति के बजाय परिपक्व एरिथ्रोसाइट्स, अर्थात् कोशिकाओं है कि hemoglobinopathies से प्रभावित रोगियों के लिए कार्यात्मक महत्वपूर्ण है सीमित है । विभिन्न रक्त समूहों के साथ रोगियों में, यह याद रखने योग्य है कि cytofluorometric विश्लेषण लाल रक्त कोशिकाओं में chimerism की पहचान करने में सक्षम है मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए निर्देशित एरिथ्रोसाइट प्रतिजनों के ऊपर और सी, सी, डी, ई, और ई10 , 11. एक अलग है, लेकिन erythroid वंश में chimerism का आकलन करने का बहुत ही दिलचस्प साधन progenitors की परख में erythroid द्वारा erythroid जनक और विभिन्न संवर्धन clonogenic प्रकारों के चयन की छंटाई cytometric प्रवाह का संयोजन है, 12STR के विश्लेषण के बाद । इस दृष्टिकोण को दाता के सापेक्ष अनुपात-बनाम erythroid डिब्बे में प्राप्तकर्ता chimerism है और रणनीति में उपयोग के लिए अस्थि मज्जा भ्रष्टाचार को बनाए रखने में सक्षम हो सकता है ।
1. बहु-पैरामीटर प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई द्वारा टेम अस्थि मज्जा कोशिकाओं का अलगाव नमूना धुंधला प्रक्रिया शुरू करने से पहले, निंन आइटमों को एकत्रित करने की आवश्यकता है और तैयार: <…
वर्तमान अध्ययन के उद्देश्य के लिए दर्शकों को erythroid progenitors में दाता/प्राप्तकर्ता chimerism का विश्लेषण करने के लिए दो दृष्टिकोण का एक संयोजन प्रदान करना है hemoglobinopathies के लिए इलाज रोगियों में HSCT निंनलिखित: 1.) प्रतिदीप्…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol ने सपोर्ट किया था ।
Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |