Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno
Summary
Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.
Abstract
Terapias basadas en células autólogas consiguieron un paso más a la realidad con la introducción de células madre pluripotentes inducidas. Células madre fetales, líquido amniótico y células madre mesenquimales en membrana representan un tipo especial de células indiferenciadas con promesa en la ingeniería de tejidos y de reprogramación en iPSC para futuras intervenciones pediátricas y banca de la célula de vástago. El protocolo que presentamos describe un procedimiento optimizado para la extracción y cultivo primario amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales y generando episomal inducida por células pluripotentes de estas células en cultura totalmente químicamente definida condiciones de utilización de vitronectina recombinante humana y el medio de E8. También se describe la caracterización de las nuevas líneas mediante la aplicación de métodos rigurosos – citometría de flujo, proyección de imagen confocal, formación de teratoma y perfilamiento transcripcional. Las líneas recién generadas expresan marcadores de células madre embrionarias – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4, mientras que siendo negativo para el marcador SSEA-1. Las líneas de células madre forman teratomas en ratones scid-beige en 6-8 semanas y los teratomas contienen tejidos representativos de las tres capas del germen. Transcripcional de perfiles de las líneas mediante la presentación de datos de microarrays de expresión global a un algoritmo de evaluación bioinformática pluripotencia consideran todas las líneas pluripotentes y por lo tanto, este enfoque es una alternativa atractiva a los ensayos con animales. Las nuevas líneas de iPSC pueden utilizarse fácilmente en experimentos posteriores con la optimización de la diferenciación y la ingeniería de tejidos.
Introduction
La tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), trae consigo potenciales terapias de reemplazo celular, enfermedad y desarrollo modelado y drogas y detección toxicológica1,2,3. Terapias de reemplazo de expresiones se logra por la inyección de la célula, in vitro había distinguido implantación de tejido (como los parches cardíacos), o la regeneración guiada mediante ingeniería de tejidos. Líquido amniótico (AFSC) y células de membrana (AMSC) son una excelente fuente de células para estas intervenciones ya sea directamente4,5,6,7 o como una población celular a partir de reprogramación en pluripotencia8,9,10,11,12.
Primeros enfoques utilizan sistemas de cultivo indefinido o reprogramación métodos que requieren implican integración genómica de construye9,10,11,12. Un estudio más reciente empleó un medio libre de xeno, aunque se utilizó una matriz de accesorio menos definida de la membrana del sótano (BMM), para generar iPSC a partir de las células epiteliales del líquido amnióticas. Sin embargo, el ensayo de formación de teratoma no fue incluido en el estudio junto con una amplia variedad de datos moleculares y in vitro. Las células epiteliales del líquido amnióticas fueron encontradas para tener una áspero 8-fold reprogramación una eficacia más alta en comparación con los fibroblastos neonatales13. En otro estudio, las células madre mesenquimales de líquido amniótico también fueron encontradas para ser reprogramado en iPSC con una mucho mayor eficiencia12.
Células madre pluripotentes pueden ser distinguidas en representante de tejidos de todas las capas germinales 3 y por lo tanto tienen el potencial más amplio. Pacientes pediátricos podrían beneficiarse de la cosecha, reprogramación e Ingeniería del tejido fino de sus células madre líquidos amnióticos autólogas prenatally y células madre de la membrana amniótica durante el período perinatal. Por otra parte, el relativamente bajo nivel de diferenciación de células fetales de la madre (menores de14,de las células madre adultas15) teóricamente podría ayudar en el tratamiento de la retención observada de sesgo epigenético de las células de origen en iPSC16.
Aquí presentamos un protocolo para la reprogramación de líquido amniótico y membrana células madre de pluripotencia en químicamente definidos gratis xeno E8 medio vitronectina recombinante17 (VTN) usando plásmidos episomal18. La principal ventaja de amniótico líquido y membrana de las células como fuente de células para la reprogramación radica en su disponibilidad pre y perinatal y por lo tanto este enfoque beneficiaría principalmente a investigación en ingeniería de tejidos pediátricos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fase inicial de generación de iPSC de células madre fetales consiste en la extracción de las células de origen de los tejidos fetales, su cultura, la expansión y la introducción de la plásmidos reprogramación episomal. Esta fase es seguida por un período de cultivo de alrededor de 14-18 días antes de las primeras colonias totalmente reprogramadas pueden ampliarse. La última fase es la maduración de los clones de iPSC. La extracción inicial de las células de vástago de la membrana amniótica se consigue …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Fonds Medizinische Forschung en la Universidad de Zurich, Forschungskredit de la Universidad de Zurich, la NMS SCIEXCh 10.216 becas y 12.176, la sociedad Suiza de Cardiología, la Swiss National Science Fundación bajo concesión [320030-122273] y [310030-143992], el 7 º Programa marco, válvula de vida, la Comisión Europea bajo Grant [242008], la Fundación de Mayenfisch Olga, la Fundación EMDO, la concesión inicial 2012 de la Hospital Universitario de Zurich, y financiamiento interno del Instituto de cáncer de Mitchell.
Materials
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette – transfection pipette Neon device – transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip – transfection tip Neon tube – transfection tube buffer R – resuspension buffer buffer E – electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
Riferimenti
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