Summary

Hoog vet dieet voeding en High Throughput triglyceride test bij Drosophila Melanogaster

Published: September 13, 2017
doi:

Summary

Dit is een hoog vet dieet voeding protocol om zwaarlijvigheid in Drosophila, een model voor begrip fundamentele moleculaire mechanismen betrokken bij lipotoxicity. Het biedt ook een hoge doorvoersnelheid triglyceride assay voor het meten van vet accumulatie in Drosophila en mogelijk andere (insect) modellen onder verschillende voeding, milieu, genetische of fysiologische omstandigheden.

Abstract

Hart-en vaatziekten is de nummer een doodsoorzaak menselijke wereldwijd. Talrijke studies hebben aangetoond sterke verbindingen tussen obesitas en cardiale storing bij de mens, maar meer tools en onderzoeksinspanningen zijn nodig beter het ophelderen van de mechanismen die betrokken zijn. Voor meer dan een eeuw, het genetisch zeer hanteerbare model van Drosophila behulpzaam geweest bij de ontdekking van belangrijke genen en moleculaire trajecten die bleek te sterk over soorten worden behouden. Veel biologische processen en mechanismen van de ziekte zijn functioneel bewaard in de vlieg, zoals ontwikkeling (b.v., lichaam plan, hart), kanker en neurodegeneratieve ziekte. Onlangs, heeft de studie van obesitas en secundaire ziekten, zoals hart-en vaatziekten in modelorganismen, een zeer cruciale rol gespeeld bij de identificatie van belangrijke regelgevende instanties die betrokken zijn bij metabool syndroom bij de mens.

Wij stellen hier, met deze model-organisme als een doeltreffend instrument te induceren van obesitas, dat wil zeggen, buitensporige accumulatie van vet en het ontwikkelen van een efficiënt protocol voor het controleren van vetgehalte in de vorm van TAGs accumulatie. Naast de zeer geconserveerde, maar minder complex genoom heeft de vlieg ook een korte levensduur voor snelle experimenten, gecombineerd met de kosteneffectiviteit. Dit witboek biedt een gedetailleerd protocol voor hoog vet dieet (HFD) voeding in Drosophila voor het opwekken van obesitas en een kwantitatieve analyse van hoge-doorvoer, triglyceride (TAG) voor het meten van de bijbehorende stijging van het vetgehalte, met het oog op het zeer reproduceerbaar zijn en efficiënt voor grootschalig onderzoek voor genetische of chemische. Deze protocollen bieden nieuwe mogelijkheden om efficiënt regulerende mechanismen die betrokken zijn bij obesitas te onderzoeken, evenals een gestandaardiseerd platform te bieden voor Drugsonderzoek van de ontdekking voor snelle testen van het effect van drugkandidaten op de ontwikkeling of preventie van obesitas, diabetes en verwante metabole ziekten.

Introduction

We zijn in een tijd waar obesitas, en de bijbehorende economische lasten, is een wereldwijd probleem1. Twee uit elke drie Amerikanen zijn overgewicht of obesitas met verwante hart pathologieën, de belangrijkste doodsoorzaak in de volwassen bevolking2. Nieuwe efficiënte methoden zijn nodig om de genetische en moleculaire componenten betrokken bij de regulering van metabool syndroom met behulp van modelorganismen adequaat te onderzoeken. Om deze reden kiezen wij de fruitvlieg Drosophila model omdat het de meest elementaire biologische processen met zoogdieren, waaronder muizen en mensen3,4,5,6. Drosophilagenoom is zeer geconserveerde tijdens de evolutie, maar over het algemeen veel kleiner met minder gene duplicatie en metabole complexiteit, waardoor hij ideaal is voor het begrip van de fundamentele mechanismen betrokken bij vele ziekten bij de mens4 , 7 , 8. ook karakteristieke processen uitgevoerd door adipeus weefsel, de darm en pancreas zijn vertegenwoordigd in de vlieg en bemiddelen van regelgevende taken in glucose en lipide metabolisme, bijvoorbeeld, die vergelijkbaar met de mens9, zijn 10,11. Bovendien, de fundamentele moleculaire pathways betrokken bij de bestrijding van zwaarlijvigheid, insulineresistentie en diabetes bij de mens zijn functioneel bewaard in Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. als hogere organismen, Drosophila heeft een kloppend hart die tijdens de ontwikkeling wordt gevormd door soortgelijke processen met die van de zoogdieren hart3,17. Dus, de ontwikkeling van een betrouwbare HFD voeding protocol en hoge doorvoer TAG assay, aangepast voor efficiënte screening doeleinden gebruik van de genetische gereedschapskist van Drosophila, bieden een belangrijk middel te bestuderen en begrijpen van de fundamentele genetische basis onderliggende complexe metabole ziekten.

Het HFD voedsel zelf is gemaakt van een standaard laboratorium vliegen voedsel aangevuld met kokosolie, die meestal uit verzadigde vetzuren bekend bestaat te worden geassocieerd met het metabool syndroom18. Terwijl inducerende obesitas in modellen, zoogdieren, zoals knaagdieren, maanden19,20 duren kan, verhoogt onze geoptimaliseerde HFD voeding protocol in Drosophila effectief en reproducibly organisch vetgehalte in een kwestie van dagen12,14. Dit protocol, kunt in combinatie met een hoge doorvoersnelheid TAG assay, u efficiënt mass screening voor de gevolgen van genetische factoren, milieu-invloeden en drugkandidaten te ontdekken van nieuwe modulatoren van vetstofwisseling. Als gevolg hiervan zijn deze protocollen waarschijnlijk relevant zijn voor het begrijpen en/of bestrijding van obesitas en obesitas-geassocieerde menselijke pathologie.

De voeding protocol is veelzijdig en kan worden toegepast om te bestuderen van de metabole en functionele gevolgen van enkele verzadigde of onverzadigde vetzuur. Het gebruik van deze hoge doorvoer TAG assay is niet beperkt tot D. melanogaster, maar kan worden aangepast aan een verscheidenheid van kleine modelorganismen met Cuticula of taai extracellulaire matrices (b.v., andere soorten Drosophila , C. elegans en andere opkomende ongewervelde modelorganismen) voor het meten van vetgehalte onder verschillende ecologische, genetische of fysiologische omstandigheden, in elk stadium van ontwikkeling, volwassenheid of fase van metabole ziekte. De TAG-bepaling is gebaseerd op een colorimetrische meting van een reeks enzymatische reacties dat degraderen de TAGs in vrije vetzuren, glycerol, Glycerol-3-fosfaat en ten slotte H2O2 die met 4-aminoantipyrine (4-AAP) en 3,5 reageert- dichloorethaan-2-hydroxybenzene sulfonaat (3,5 DHBS) om een rood gekleurde product dat wordt gemeten met een spectrofotometer 96-Wells te produceren.

Protocol

1. HFD voeding Protocol tabel 1. Vliegen eten recept. Deze tabel bevat een overzicht van de verschillende ingrediënten gebruikt onze controle om voedsel te bereiden. Zodra gemaakt, 10 mL van het levensmiddel wordt gegoten in flesjes, gekoeld en opgeslagen bij 4 ° C voor lange termijn opslag. HFD voorbereiding om 1 kg vet voedsel, weeg 700 g van pre-en-klare no…

Representative Results

In D. melanogaster, zoals het geval met andere soorten, is er seksueel dimorfisme tussen mannetjes en vrouwtjes22. Het is algemeen bekend dat de vrouwtjes groter, met meer vet in hun buikjes, dan mannetjes22 zijn. Om te testen van de effectiviteit van ons protocol, we uitgevoerd TAG testen om te bepalen van de verschillen in-TAG inhoud tussen mannetjes en vrouwtjes van standaard laboratorium wildtype (w1118) vlie…

Discussion

Obesitas inductie in muizen kun je maanden19,20. In vliegen voorziet deze HFD voeding protocol inductie van overtollige vet accumulatie in een kwestie van dagen of minder, waardoor verhogingen in vet ophoping pas na 18 h (Zie Figuur 2). HFD vervoederen van het beschreven protocol verhoogt glucose inhoud 12 en vermindert Bmm lipase en PGC-1 expressie24. Dit is in tegenstelling t…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zouden graag bedanken Erika Taylor voor het bewerken van dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 en R01 HL054732) naar R.B., een post-doctoraal onderzoek supplement (R01 HL085481) en fellowship (AAUW) aan S.B.D. en subsidies van de American Heart Association aan S.B.D. en R.T.B.

Materials

Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
Triglyceride Standard Stanbio #2103 – 030
Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

Riferimenti

  1. Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
  2. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015)
  3. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
  4. Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
  5. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
  6. Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
  7. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  8. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  9. Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
  10. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
  11. Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
  12. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
  13. Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
  14. Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
  15. Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
  16. Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
  17. Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
  18. Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
  19. Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
  20. Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
  21. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
  22. Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetica. 205, 1215-1228 (2017).
  23. Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).
  24. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
  25. Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
  26. Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
  27. Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
  28. Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
  29. Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
  30. Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
  31. Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).

Play Video

Citazione di questo articolo
Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

View Video