Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.
Summary
Esta é uma dieta de alta gordura protocolo para induzir obesidade em Drosophila, um modelo para a compreensão fundamental molecular os mecanismos implicados na lipotoxicity de alimentação. Ele também fornece um ensaio de triacilglicerol alto throughput para medir o acúmulo de gordura em Drosophila e potencialmente outros modelos (insetos) sob diferentes condições de dieta, ambientais, genéticas ou fisiológicas.
Abstract
Doença cardíaca é a principal causa de morte humana no mundo. Numerosos estudos têm demonstrado forte ligação entre obesidade e mau funcionamento cardíaco em humanos, mas mais ferramentas e esforços de pesquisa são necessários para melhor elucidar os mecanismos envolvidos. Para mais de um século, o modelo geneticamente altamente tratável de Drosophila tem sido fundamental na descoberta de genes-chave e vias moleculares que provou ser altamente conservadas em toda a espécie. Muitos processos biológicos e mecanismos de doença são funcionalmente conservados na mosca, como desenvolvimento (por exemplo, plano de corpo, coração), câncer e doenças neurodegenerativas. Recentemente, o estudo da obesidade e patologias secundárias, tais como doença em organismos-modelo, tem desempenhado um papel altamente crítico na identificação dos principais reguladores envolvidos na síndrome metabólica em seres humanos.
Aqui, propomos usar esse organismo modelo como uma ferramenta eficiente para induzir a obesidade, ou seja, acumulação excessiva de gordura e desenvolver um protocolo eficiente para monitorar o teor de gordura sob a forma de acumulação de TAGs. Além de altamente conservadas, mas menos complexo genoma, a mosca também tem uma vida curta para a experimentação rápida, combinada com a relação custo-eficácia. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a alimentação de alta gordura dieta (HFD) em Drosophila para induzir a obesidade e um ensaio de triacilglicerol (TAG) de alto rendimento para medir o associado aumento no teor de gordura, com o objectivo de ser altamente reprodutível e eficiente para rastreio genético ou químico em larga escala. Estes protocolos oferecem novas oportunidades para eficientemente investigar mecanismos reguladores envolvidos na obesidade, bem como fornecer uma plataforma padronizada para a pesquisa de descoberta de drogas para testes rápidos do efeito de candidatos da droga sobre o desenvolvimento ou prevenção da obesidade, diabetes e doenças metabólicas associadas.
Introduction
Estamos em um tempo onde a obesidade e seus associados encargos económicos, é um problema mundial1. Dois em cada três americanos estão com sobrepeso ou obesos com patologias do coração relacionadas, a principal causa de morte dentro da população adulta2. Novos métodos eficientes são necessários para investigar adequadamente os componentes genéticos e moleculares implicados na regulação da síndrome metabólica, usando organismos modelo. Por esta razão, nós escolhemos o mosca de fruta Drosophila modelo porque ele compartilha os processos biológicos mais básicos com mamíferos, incluindo ratos e seres humanos3,4,5,6. Genoma de drosophilaé altamente conservadas durante a evolução, mas no geral é muito menor com menos duplicação de genes e complexidade metabólica, tornando-a ideal para compreender os mecanismos fundamentais implicados em muitas doenças humanas4 , 7 , 8. Além disso, característico de processos realizados pelo tecido adiposo, intestino e pâncreas são representados na mosca e mediar funções reguladoras no metabolismo glicose e lipídios, por exemplo, que são semelhantes aos seres humanos9, 10,11. Além disso, as vias moleculares básicas envolvidos no controle da obesidade, resistência à insulina e diabetes em seres humanos são funcionalmente conservadas em Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. como organismos superiores, Drosophila tem um coração que é formado durante o desenvolvimento de processos semelhantes do coração dos mamíferos3,17. Assim, o desenvolvimento de um confiável HFD alimentação protocolo e ensaio de TAG alto throughput, adaptado para fins de triagem eficiente usando a caixa de ferramenta genética da Drosophila, fornecem um meio importante para estudar e entender a base genética fundamental doenças metabólicas complexas subjacentes.
O próprio alimento HFD é feito a partir de um alimento mosca de laboratório padrão suplementado com óleo de coco, que é composto principalmente de ácidos graxos saturados, conhecidos por ser associado com a síndrome metabólica18. Enquanto induzir obesidade em modelos de mamíferos, como roedores, pode levar meses19,20, nosso HFD otimizado protocolo de alimentação em Drosophila eficazmente e reproducibly aumenta a gordura em questão de dias12,14. Este protocolo, em conjunto com um ensaio de alto throughput TAG, permite eficiente triagem em massa para os efeitos de fatores genéticos, influências ambientais e candidatos a fármacos para descobrir novos moduladores do metabolismo das gorduras. Em consequência, estes protocolos são prováveis relevantes para entender e/ou combater a obesidade e patologias humanas associadas a obesidade.
O protocolo de alimentação é versátil e pode ser aplicado para estudar os efeitos metabólicos e funcionais do único de ácidos gordos saturados ou insaturados. O uso deste teste de TAG de alta taxa de transferência não está limitado a d. melanogaster, mas pode ser adaptado a uma variedade de organismos modelo pequeno com cutícula ou matrizes extracelulares duros (por exemplo, outras espécies de Drosophila , c. elegans e outros emergentes organismos invertebrados modelo) para medir o teor de gordura em diferentes condições ambientais, genéticas ou fisiológicas, em qualquer fase de desenvolvimento, maturidade ou fase da doença metabólica. O ensaio de TAG é baseado em uma medição colorimétrica de uma série de reações enzimáticas que degradam as TAGs em ácidos graxos livres, glicerol, o glicerol-3-fosfato e finalmente H2O2 , que reage com 4-aminoantipyrine (4-AAP) e 3,5- dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato (3,5 DHBS) para produzir um produto de cor vermelho que é medido utilizando um Espectrofotômetro de 96 poços.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indução de obesidade em ratos pode levar meses19,20. Nas moscas, este HFD alimentando o protocolo permite a indução de acúmulo de gordura em excesso em questão de dias ou menos, causando aumentos no acúmulo de gordura somente após 18 h (ver Figura 2). HFD alimentando com o protocolo descrito aumenta o conteúdo de glicose 12 e Bmm lipase e PGC-1 expressão24. Isto está…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Erika Taylor para edição deste manuscrito. Este trabalho foi financiado por subvenções provenientes do National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 e HL054732 R01) de R.B., um suplemento de investigação pós-doutoramento (R01 HL085481) e companheirismo (AAUW) para S.B.D., concessões e da associação americana do coração para S.B.D. e RGB
Materials
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
Riferimenti
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