Нанотрубках ДНК как универсальный инструмент для изучения полугибких полимеров
Summary
Полугибких полимеров отображения уникальные механические свойства, которые широко применяются в живущих систем. Однако систематические исследования биополимеров ограничены, поскольку такие свойства, как жесткость полимера недоступны. Эта рукопись описывает, как обойти это ограничение, программируемые ДНК нанотрубок, позволяя экспериментальные исследования о влиянии накаливания жесткости.
Abstract
Механические свойства сложных, на полимерной основе мягкой материи, например клетки или биополимеров сетей, может пониматься в ни классической рамке гибких полимеров, ни жестких стержней. Основные нити остаются вытянутой вследствие их жесткость не исчезающие позвоночника, который количественно через сохранение длины (lp), но они также subject to сильные зыбкост тепловой. Их конечный изгиб жесткость приводит к уникальным, нетривиальные коллективных механики сыпучих сетей, позволяя формирования стабильных подмостей на низкой громкости фракций обеспечивая большие сетки размерами. Этот основополагающий принцип широко распространены в природе (например, в клетки или ткани), минимизации высокой молекулярной содержание и способствуя диффузионных или активного транспорта. Благодаря их биологические последствия и потенциальные технологические приложения в биосовместимые гидрогели полугибких полимеров претерпели значительные исследования. Однако понятной расследований остается сложной, поскольку они полагались на природные полимеры, такие как филаментов актина, которые не являются свободно перестраиваемый. Несмотря на эти ограничения и отсутствием синтетических, механически перестраиваемый и полугибких полимеров филаментов актина были созданы в качестве общей модели системы. Основным ограничением является, что Центральный количество lp не могут быть настроены свободно изучить ее влияние на макроскопических массовых структур. Это ограничение была решена путем применения структурно программируемых нанотрубках ДНК, включение контролируемые изменения жесткости накаливания. Они формируются через плитки основе конструкции, где дискретный набор частично дополнительные пряди гибридизировать в кольцевую структуру с дискретной окружности. Эти кольца имеют липкие концы, позволяя эффективные полимеризации в нити несколько мкм в длину и отображать аналогичные кинетика полимеризации как природные биополимеры. Из-за их программируемых механики эти трубы являются универсальным, Роман инструменты для изучения влияния lp на сингл молекулы, а также основная шкала. В отличие от филаментов актина они остаются стабильными в течение недель, без заметных дегенерации, и их обработка сравнительно проста.
Introduction
Из-за сложного поведения, благодаря их уникальным механических свойств полугибких Полимеры являются базовыми стандартными блоками живой материи. В отличие от гибких полимеров полугибких полимеров принять вытянутой конфигурации из-за их не исчезает скованность позвоночника оставаясь при условии сильные термические флуктуации1. Таким образом чисто стохастических моделей не может применяться к их поведение, как и в случае с крайностями полностью гибкие или жесткие полимеров. Для количественной оценки этой жесткости через lp, который является константа распада тангенс тангенс корреляции вдоль нити накала4был разработан так называемый червь как цепь модель2,3,4 . Если lp сопоставима с контурной длины (lc) нити накала, полимер считается полугибких1. Аналогично поляков палатки, их механизмов в сетях или пучки стабилизирует всю коллективной системы при низкой громкости фракций, приводит к необычным вязкоупругие свойства5,6,7, 8,9. Эти структуры обеспечивают высокую эластичность в целом сетка Размеры10, поддержание механическую целостность то же время содействие диффузионные и процессы активного транспорта. Это свойство особенно подходит для биологических систем, таких как цитоскелета или внеклеточного матрикса, но она также широко используется в пищевой инженерных1,,1112.
Выходящие за рамки их значимости для живой материи, важно всесторонне изучить на физические свойства этих структур для того, чтобы иметь инструменты для разработки биоимитирующие материалы или Роман гидрогели. С точки зрения полугибких полимеров это предполагает систематическое определение коллективные свойства результате сингл накаливания свойства, такие как lp и развития описательный теоретические основы сетей. В первопроходца исследования сотовой биополимера актина была учреждена в качестве модельной системы для полугибких полимеров и до сих пор считается золотым стандартом5,13,14,15 , 16 , 17. Однако, исчерпывающего исследования ограничены с этой системой, поскольку они привязаны к имманентные свойства этого белка. Различные теоретические подходы нацелены на создание Описание нетривиальных механического поведения на уровне одной нити накала и привели к особенно различных масштабирования предсказания для зависимость модуль сдвига линейных упругих плато, G 0 (то есть, «эластичность» сети), в отношении концентрации (c) и lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Хотя концентрация масштабирование легко доступны в экспериментах с актин- или другие модели системы и теоретические прогнозы были тщательно проверены13,16,24, 25, масштабирование относительно lp оставалась экспериментально недоступны. Однако, это одним из основных ограничений с lp также независимой переменной, которая является определяющей количество полугибких полимеров.
Этот центральный, природные ограничения, введенные фиксированной lp актин или других биологически производные полимеры, такие как коллаген недавно была решена путем применения плитки основе ДНК трубки, которые перестраиваемый в их механические свойства 9 , 26 , 27 , 28. небольшие вариации в архитектурах труб (например, различное количество составляющих ДНК пряди в пределах подразделения кольца) дают различные значения lp, которые могут быть оценены через микроскопии флуоресцирования, анализ одного колебания трубы либо путем оценки изогнутой конфигурации нескольких придерживался трубок как описано ранее9,28. Эти анализы показали, что lp населения различных трубка значения за более чем один порядок величины и различные оценки методов дают постоянные результаты9,28.
Удивительно общее масштабирование линейных упругих плато сдвига модуль G0 в отношении концентрации и lp было сообщено быть несовместимым с всех предыдущих теоретических подходов 9, в частности демонстрируют гораздо сильнее, чем предсказано зависимость от lp. Эти выводы подчеркивают значение новой модели системы для изучения Центральной свойства полугибких полимеров. Использование n-трубы спирали ДНК значительно расширяет сферу этих расследований. Не только может lp свободно варьироваться без изменения основной материал, но присущие программируемый характер ДНК можно включить систематического рассмотрения дополнительных элементов, таких как сшивки или кинетическим переключения процессов. Кроме того эти трубы растворимы в воде и, в отличие от большинства белков, стабильная в адекватных pH и ионных условий в течение нескольких недель, без обнаружению деградации9.
Чтобы собрать эти трубы, используется дискретный набор ДНК-олигонуклеотиды, каждый из которых содержит два домены, использующие дополнительные базовые последовательности для двух соседних нитей (из-за специфических последовательностей, одиночной стренги не может сформировать структуры, такие как шпильки). Дополнительные последовательности гибридизируйте циклическим образом, образуя замкнутые, половина перекроя кольца n в взаимосвязанные двойной винтовой сегментов (рис. 1а и B). Эти формы кольца на дискретные диаметр (рис. 1 c) и их половину перекрытие конфигурации предоставляет осевой липкие концы дополняет липкие концы другого кольца. Это селективный Добавление сопоставления олигонуклеотиды триггеров, укладывая колец, ведущих к эффективной полимеризации нитчатые трубы спирали ДНК размера n (nHT). Их контуров длины обычно измеряют несколько мкм в длину, и их распределение длины сопоставим с миозина нитей9,26,27,28. Для подобных нанотрубках ДНК показано, что они действительно обладают кинетика полимеризации аналогичны филаментов актина и микротрубочеккласс p = «внешней» > 29. В зависимости от числа n отдельных нитей ДНК, составляющих структуру основного кольца, nHT архитектуры, а также его окружности и диаметр, можно варьировать controllably. С помощью более нитей ДНК увеличивается окружность трубы кольца, и соответствующее изменение архитектуры смены механических свойств на более высокие значенияp l(рис. 1 c), соответствует более высокой жесткости. На шкале мезоскопических эти большие значенияp lперевести на менее изогнутой конформации из-за более высокой жесткости (рис. 1 d и E).
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы получить правильно сформированные сетей, монтаж нанотрубках ДНК представляет собой решающий шаг. Ошибки во время процесса синтеза отрицательно влияют на качество трубки; Поэтому рекомендуется использовать для очистки олигонуклеотиды ВЭЖХ или более строгий процесс. Поскольку ф…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем, финансирование DFG (1116/17-1) и Лейпциг школа естественных наук «BuildMoNa» (GSC 185). Эта работа оказывалась через Fraunhofer привлечь проекта 601 683. Т. ч. признает финансирование из Европейского социального фонда (ЕСФ-100077106).
Materials
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM – NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore – Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
Riferimenti
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
- Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
- Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
- MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
- Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
- Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
- Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
- Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
- Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
- Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
- Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
- Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
- Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
- Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
- Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
- Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
- Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
- Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
- Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
- Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
- Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
- Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
- Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
- Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
- Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
- de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
- Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
- Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
- You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
- Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
- Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
- Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
- Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
- Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
- Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
- Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
- Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
- Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
- Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
- Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
- Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).
