JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Bioingegneria

DNA nanorør som et alsidigt værktøj til at studere Semiflexible polymerer

Published: October 25, 2017
doi:
10.3791/56056
, , , , , , , ,
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I,Universität Leipzig

Summary

Semiflexible polymerer vise enestående mekaniske egenskaber, der er i vid udstrækning anvendes af levende systemer. Systematiske undersøgelser på Biopolymerer er dog begrænset, da egenskaber såsom polymer stivhed er utilgængelige. Dette manuskript beskriver, hvordan denne begrænsning er omgået af programmerbare DNA nanorør, aktivering af eksperimentelle undersøgelser af virkningen af glødetrådens stivhed.

Abstract

Mekaniske egenskaber af komplekse, polymer-baserede blødt materiale, såsom celler eller polymer netværk, kan forstås i hverken klassisk ramme af fleksible polymerer eller af stiv stænger. Underliggende filamenter forbliver udstrakte på grund af deres ikke-vanishing rygraden stivhed, som skal være talbestemt via persistens længde (lp), men de er også underlagt stærke termisk udsving. Deres begrænsede bøjning stivhed fører til unikke, ikke-trivielle kollektive mekanik af bulk netværk, gør det muligt for dannelsen af stabil stilladser på lav volumenbrøkerne samtidig store maskestørrelser. Dette grundlæggende princip er udbredt i naturen (f.eks. i celler eller væv), minimere høj Molekylær indhold og dermed lette diffuserende eller aktiv transport. På grund af deres biologiske virkninger og potentielle teknologiske applikationer i biokompatible hydrogels, har semiflexible polymerer været genstand for betydelig undersøgelse. Men forståelige undersøgelser forblev udfordrende, da de har påberåbt sig naturlige polymerer, såsom actin filamenter, der ikke er frit afstemmelige. På trods af disse begrænsninger, og på grund af manglende syntetiske, mekanisk afstemmelige og semiflexible polymerer blev actin filamenter etableret som den fælles modelsystem. En stor begrænsning er, at centrale mængde lp ikke kan indstilles frit for at studere dens indvirkning på makroskopisk bulk strukturer. Denne begrænsning blev løst ved at ansætte strukturelt programmerbare DNA nanorør, gør det muligt for kontrolleret ændring af glødetrådens stivhed. De er dannet gennem flise-baseret design, hvor et diskret sæt af delvist supplerende tråde krydse sig i en ring struktur med en diskret omkreds. Disse ringe indslag sticky ender, muliggør den effektive polymerisering til filamenter flere mikron i længde, og vise lignende polymerisering kinetik som naturlige Biopolymerer. På grund af deres programmerbare mekanik er disse rør alsidige, Roman værktøjer til at undersøge virkningen af lp på enkelt-molekyle samt bulk skala. I modsætning til actin filamenter, de forbliver stabil i løbet af uger, uden bemærkelsesværdige degeneration, og deres håndtering er forholdsvis ligetil.

Introduction

På grund af de komplekse adfærd aktiveres med deres unikke mekaniske egenskaber, er semiflexible polymerer grundlæggende byggesten af levende materiale. I modsætning til fleksibel polymerer vedtage semiflexible polymerer en fremstrakt konfiguration på grund af deres ikke-vanishing rygraden stivhed samtidig stadig underlagt stærke termisk udsving1. Således kan ikke rent stokastiske modeller anvendes på deres adfærd, som med ekstremer af fuldt fleksibelt eller stift polymerer. Den såkaldte ormelignende kæde model2,3,4 blev udviklet for at kvantificere denne stivhed via lp, som er konstanten henfald af tangent-tangent korrelation langs glødetrådens4. Hvis lp er sammenlignelig med den contour længde (lc) af glødetråden, betragtes polymeren semiflexible1. Svarende til polerne i et telt, deres ordninger i netværk eller bundter stabiliserer hele det kollektive system på lav volumenbrøkerne, fører til usædvanlige viskoelastiske egenskaber5,6,7, 8,9. Disse strukturer giver høj elasticiteter på store mesh størrelser10, opretholde mekaniske integritet stadig letter diffuserende og aktiv transport processer. Denne egenskab er især velegnet til biologiske systemer såsom cytoskelettet eller den ekstracellulære matrix, men det er også almindeligt anvendt i fødevarer engineering1,11,12.

Går ud over deres betydning til levende materiale, er det afgørende at grundigt undersøge de fysiske egenskaber af disse strukturer for at have værktøjer til at udvikle biomimetiske materialer eller roman hydrogels. Med hensyn til semiflexible polymerer indebærer dette systematisk bestemmelse af de kollektive egenskaber net som følge af single-filament egenskaber såsom lp og udviklingen af en beskrivende teoretisk ramme. I banebrydende undersøgelser, cellulære polymer actin blev etableret som et modelsystem for semiflexible polymerer og er stadig i vid udstrækning betragtes som guldstandarden5,13,14,15 , 16 , 17. men udtømmende undersøgelser er begrænset med dette system, da de er bundet til de iboende egenskaber af dette protein. Forskellige teoretiske tilgange har til formål at opbygge en beskrivelse af den ikke-trivielle mekaniske opførsel på single-filament niveau og ført til især forskellige skalering forudsigelser for afhængighed af lineære elastisk plateau shear modulus, G 0 (dvs. “elasticiteten” i netværket), koncentration (c) og lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mens koncentrationen skalering er let tilgængelige i eksperimenter med actin-baseret eller andre modelsystemer og mens teoretiske forudsigelser har været strengt kontrolleret13,16,24, 25, skalering med hensyn til lp er forblevet eksperimentelt utilgængelige. Dette, er imidlertid en stor begrænsning, da lp er også en uafhængig variabel, der er definerende mængden af semiflexible polymerer.

Dette centrale, naturlige begrænsning, der fast lp af actin eller andre biologisk afledt polymerer såsom kollagen er for nylig blevet løst ved at ansætte flise-baseret DNA rør, som er afstemmelige i deres mekaniske egenskaber 9 , 26 , 27 , 28. små variationer i arkitekturen af rør (f.eks. forskelligt antal konstituerende DNA strands inden for enhed ring) giver forskellige værdier for lp, som kan evalueres via Fluorescens mikroskopi, enten ved at analysere en svingende tube eller ved at evaluere de buede konfigurationer af flere overholdt rør, som beskrevet tidligere9,28. Disse analyser viste, at lp værdier af de forskellige rør befolkninger varierer over mere end én størrelsesorden og at forskellige evalueringsteknikker give ensartede resultater9,28.

Overraskende, er den samlede skalering af lineære elastisk plateau shear modulus G0 med hensyn til koncentration og lp blevet rapporteret at være i strid med alle tidligere teoretiske tilgange 9, navnlig demonstrerer en meget stærkere end forudsagt afhængighed lp. Disse resultater understreger værdien af en ny modelsystem at studere centrale egenskaberne for semiflexible polymerer. Ansætte n-helix DNA rør dramatisk udvider anvendelsesområdet for disse undersøgelser. Ikke alene kan lp varieres frit uden at ændre den grundlæggende materiale, men den iboende programmerbare karakter af DNA kan aktivere systematisk undersøgelse af yderligere elementer, såsom krydsbindinger eller kinetisk skifte processer. Derudover disse rør er opløseligt i vand, og i modsætning til de fleste proteiner, stabil i passende pH og ioniske betingelser i flere uger, uden påviselig forringelse9.

At samle disse rør, et diskret sæt af DNA oligonukleotider bruges, hvoraf hver indeholder to domæner, der deler komplementær base sekvenser til to tilstødende tråde (på grund af de specifikke sekvenser, en enkelt streng kan ikke danne strukturer såsom hår pins). De komplementære sekvenser krydse sig på et cyklisk måde, danner lukkede, halv-overlappende ringe n sammenkoblet dobbelt heliske segmenter (figur 1A og B). Disse ringe form på en diskret diameter (figur 1 c), og deres halv-overlappende konfiguration udsætter aksial sticky ender supplement til sticky enderne af en anden ring. Denne selektive tilsætning af matchende oligonukleotider udløser en stabling af ringe, fører til den effektive polymerisering af trådformede DNA helix rør af størrelse n (nHT). Deres contour længder typisk måle flere mikron i længden, og deres længde distribution er sammenlignelig med actin filamenter9,26,27,28. Det har vist for lignende DNA nanorør at de faktisk udviser polymerisering kinetik ligner dem af actin filamenter og mikrotubulip class = “xref” > 29. Afhængigt af det antal n af enkelte DNA-strenge, der udgør den grundlæggende ring struktur, kan nHT arkitektur, såvel som dens omkreds og diameter, controllably varieres. Ved hjælp af flere DNA-strenge øger omkredsen af ringe/rør, og den tilsvarende ændring af arkitektoniske skifter de mekaniske egenskaber til højere lp værdier (figur 1 c), svarende til en højere stivhed. På mesoskopisk skala, disse større lp værdier omsættes til mindre bøjet konformationer på grund af den større stivhed (fig. 1 d og E).

Protocol

1. forberedelse af n HTs NOTE: her, n angiver antallet af forskellige enkelt DNA-strenge, involveret i dannelsen af helix rør af en vis størrelse. For n = 8, otte forskellige enkelt DNA-strenge udgør en enhed ring. Køb DNA sekvenser (HPLC renhed renhed eller højere) fra en egnet DNA syntese service eller udfører høj kvalitet syntese og rensning (eksemplarisk sekvenser som vist i tabel 1). Resuspend frysetørret oligonukle…

Representative Results

Samling af DNA nanorør via en temperatur rampe (figur 2) er en meget pålidelig metode til at danne disse kunstige semiflexible polymerer. Disse polymerer har lignende egenskaber til deres naturligt forekommende modparter, såsom actin filamenter, men giver en langt bredere eksperimentelle ramme siden deres mekaniske egenskaber kan controllably ændret9,27 . Ligesom Biopolymerer, de kan arrangeres i …

Discussion

For at opnå korrekt udformet netværk, er samle DNA nanorør et afgørende skridt. Fejl under syntese processen indflydelse negativ på tube kvalitet; Det anbefales derfor, at HPLC eller en strengere processen bruges til at rense oligonukleotider. Siden dannelsen af diskret frem for aggregerede DNA nanorør, samt deres længde distribution, afhænger af den equimolar støkiometrisk af n konstituerende oligonukleotider inden for sæt, er det nødvendigt at remeasure koncentrationerne af indkøbte dele, siden giv…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkender, at finansiering af DFG (1116/17-1) og Leipzig skole af Natural Sciences “BuildMoNa” (GSR 185). Dette arbejde er blevet støttet gennem projektets Fraunhofer tiltrække 601 683. T. Hansen erkender, at midler fra den Europæiske Socialfond (ESF-100077106).

Materials

AFM cantilever ACTA AppNano
AFM – NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore – Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. . The Theory of Polymer Dynamics. , (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat] Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009)
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -. P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

DNA NanotubesSemiflexible PolymersSoft MatterBiopolymersFilamentsNetworksHydrogelsCell MigrationStiffnessRheologyDNA HybridizationDNA StrandsThermocyclerSample PreparationDynamic Shear RheometerSample LoadingEvaporation Prevention
check_url/it/56056?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image