Confocale Imaging van Neuropeptide Y-pHluorin: een techniek voor het visualiseren van insuline submodule exocytose in Intact lymfkliertest en menselijke eilandjes
Summary
Beschrijven we een protocol voor visualisatie van insuline exocytose in intact eilandjes met behulp van pHluorin, een pH-gevoelige groen fluorescent proteïne. Geïsoleerde eilandjes zijn besmet met adenovirus codering pHluorin gekoppeld aan het blaasje lading neuropeptide Y. Dit zorgt voor de detectie van insuline submodule fusion gebeurtenissen door confocale microscopie.
Abstract
Insuline secretie speelt een centrale rol in de homeostase van de glucose onder normale fysiologische omstandigheden zo goed zoals ziekte. Huidige benaderingen ter studie van insuline submodule exocytose gebruik electrofysiologie of microscopie gekoppeld aan de expressie van fluorescerende verslaggevers. Echter de meeste van deze technieken zijn geoptimaliseerd voor klonen cellijnen of vereisen distantiëren van de alvleesklier eilandjes. Daarentegen voorziet de methode die hier gepresenteerd in real-time visualisatie van insuline submodule exocytose in intact alvleesklier eilandjes. In dit protocol beschrijven we eerst de virale besmetting van geïsoleerde alvleesklier eilandjes met adenovirus die een pH-gevoelige groen fluorescente proteïne (GFP), pHluorin codeert, gekoppeld aan neuropeptide Y (NPY). Ten tweede, beschrijven we de confocal imaging van eilandjes vijf dagen na virale infectie en hoe u kunt controleren de secretie van insuline submodule. De besmette eilandjes zijn kort, geplaatst op een dekglaasje aan op een imaging kamer en beeld onder een rechtop scannen van laser confocal microscoop terwijl wordt voortdurend geperfundeerd met extracellulaire oplossing die verschillende prikkels. Confocale beelden verspreid over 50 µm van het eiland zijn verworven als time-lapse opnamen met behulp van een fast-resonant scanner. De fusie van insuline korrels met het plasma-membraan kan na verloop van tijd worden gevolgd. Deze procedure ook zorgt voor het testen van een batterij van stimuli in een één experiment, is compatibel met zowel muis als menselijke eilandjes en kan gecombineerd worden met verschillende kleurstoffen voor functionele beeldvorming (bijv., membraan potentiële of cytosolische calcium kleurstoffen).
Introduction
Insuline wordt geproduceerd door de beta-cellen van de alvleesklier eiland en is een zeer belangrijke regelgever van glucose metabolisme1. Overlijden of disfunctie van beta cellen glucose homeostase verstoort en leidt tot diabetes2. Insuline is verpakt in dichte-core submodules die worden uitgebracht in een Ca2 +-afhankelijke manier3. Het is van essentieel belang om volledig te begrijpen wat bepaalt insuline secretie en opent nieuwe mogelijkheden voor de identificatie van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van diabetes ophelderen hoe insuline submodule exocytose is geregeld.
Insuline exocytose is uitgebreid bestudeerd met behulp van elektrofysiologische benaderingen, zoals membraan precisiecapaciteit metingen en microscopische benaderingen in combinatie met fluorescerende moleculen. Membraan precisiecapaciteit metingen hebben goede temporele resolutie en toestaan van eencellige opnames. Echter veranderingen in de capaciteit weerspiegelen de mutatie in de oppervlakte van de cel en niet individuele fusion gebeurtenissen of insuline submodule fusie van andere niet-insuline secretoire blaasjes3onderscheiden. Microscopische benaderingen, zoals twee-foton of totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie in combinatie met fluorescerende sondes en vesikel lading eiwitten, bieden extra detail. Deze technieken vangen enkele exocytotic evenementen en ook de pre- en post exocytotic etappes en kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de exocytotic patronen in populaties van cellen3.
Fluorescerende verslaggevers zijn drie soorten: 1) de extracellulaire, 2) cytoplasmatische of 3) vesiculaire. 1) extracellulaire verslaggevers zijn polar traceurs (bijvoorbeeld, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer geel, pyranine) die kunnen worden ingevoerd via de extracellulaire milieu-4. Het gebruik van de polar verklikstoffen zorgt voor het onderzoek van de fusie porie in een bevolking van cellen en vangt diverse intercellulaire structuren zoals bloedvaten. Echter, zij niet meldt op vesikel lading gedrag. 2) cytoplasmatische verslaggevers zijn fluorescerende sondes gekoppeld aan membraan-geassocieerde eiwitten die gezicht van het cytoplasma en zijn betrokken bij docking en exocytose. Voorbeelden zijn leden van de familie oplosbare Nfactor – ethylmaleimide-sensitive bijlage eiwit receptor (SNARE) die met succes zijn gebruikt in de neurowetenschappen voor het bestuderen van de neurotransmitter versie5. Dergelijke eiwitten bevatten meerdere bindende partners en zijn niet insuline-submodule specifieke. 3) vesiculaire verslaggevers zijn fluorescerende sondes gesmolten aan vesiculaire lading eiwitten die voor het onderzoek van lading-specifieke vesikel gedrag toestaan. Insuline-submodule specifieke lading eiwitten bevatten insuline, c-peptide islet amyloïde polypeptide en NPY o.a.6,7. NPY is alleen aanwezig in de insuline die submodules bevatten, en wordt mede uitgebracht met insuline, waardoor het een uitstekende partner voor een fluorescerende verslaggever8.
De fusie van verschillende fluorescente proteïnen te NPY eerder heeft gewerkt aan het bestuderen van de verschillende aspecten van exocytose in neuro-endocriene cellen, zoals bijvoorbeeld het vereiste van specifieke synaptotagmin isoforms9,10 en hoe de tijdsverloop van release hangt af van het cytoskelet actine en myosin II11,12. In deze studie kozen we pHluorin als de fluorescerende verslaggever, die is een gemodificeerde GFP thats niet-belichting fluorescerende bij de zure pH in dichte kern korrels, maar wordt helder fluorescerende bij blootstelling aan de neutrale extracellulaire pH-13. Volwassen insuline korrels hebben een zure pH onder de 5.5. Zodra de submodule met de plasmamembraan en opent smelt, wordt de lading wordt blootgesteld aan de neutrale extracellulaire pH van 7,4, waardoor het gebruik van de pH-gevoelige eiwitten-pHluorin als verslaggever7,14.
Gezien de gevoelige aard van de pH van de pHluorin en de selectieve expressie van NPY in insuline korrels, kan de structuur van de fusie van de NPY-pHluorin worden gebruikt om te bestuderen van de verschillende eigenschappen van insuline submodule exocytose. De virale levering van de fusion constructie zorgt voor een hoge transfectie efficiëntie en werkt op primaire beta cellen of cellijnen en geïsoleerde eilandjes. Deze methode kan ook worden gebruikt als een richtsnoer voor de studie van exocytose in een ander celtype met NPY-bevattende blaasjes. Het kan ook worden gecombineerd met een transgeen muismodel effecten van bepaalde voorwaarden (knockdowns, overexpressie, enz.) te bestuderen op exocytose. Deze techniek is eerder gebruikt voor het karakteriseren van de ruimtelijke en temporele patronen van insuline secretie van de submodule in bèta cel populaties in menselijke eilandjes15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript beschrijft een techniek die kan worden gebruikt voor het visualiseren van exocytose van insuline korrels in beta cellen binnen intact alvleesklier eilandjes door confocale microscopie. Het maakt gebruik van NPY-pHluorin als de fluorescerende verslaggever gekloond in adenovirus een hoge transfectie efficiëntie te waarborgen.
Hoewel de methode uiterst efficiënt in onze handen was, het wellicht enkele wijzigingen die vooral afhankelijk zijn van twee parameters: 1) de kwaliteit va…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Marcia Boulina uit de DRI imaging core faciliteit voor hulp met de microscopen. Dit werk werd gesteund door de NIH subsidies 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 en R56 DK084321 (AC).
Materials
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
Riferimenti
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?. Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
