Konfokal Imaging af neuropeptid Y-pHluorin: en teknik til at visualisere Insulin granulet exocytose i intakt Murine og menneskelige Holme
Summary
Vi beskriver en protokol for visualisering af insulin exocytose i intakt Holme ved hjælp af pHluorin, en pH-følsom grøn fluorescerende proteiner. Isolerede øer er inficeret med adenovirus kodning pHluorin koblet til vesikel cargo neuropeptid Y. Dette giver mulighed for påvisning af insulin granulet fusion begivenheder af Konfokal mikroskopi.
Abstract
Insulinsekretion spiller en central rolle i glukose homøostase under normale fysiologiske forhold såvel som sygdom. Nuværende metoder til at studere insulin granulet exocytose enten bruge Elektrofysiologi eller mikroskopi koblet til udtryk af fluorescerende journalister. Men de fleste af disse teknikker er blevet optimeret til klonede cellelinjer eller kræve, at miljøomkostningerne i bugspytkirtlen Holme. Derimod tillader metoden præsenteres her for realtid visualisering af insulin granulet exocytose i intakt i bugspytkirtlen Holme. I denne protokol beskrive vi først virusinfektion i isolerede pancreas Holme med adenovirus, der koder en pH-følsom grøn fluorescerende proteiner (NGL), pHluorin, koblet til neuropeptid Y (NPY). For det andet beskriver vi de Konfokal imaging af Holme fem dage efter virusinfektion, og hvordan man kan overvåge granulet insulinsekretion. Kort, de inficerede Holme er placeret på en coverslip på en billeddannelse kammer og afbildet i en opretstående laser-scanning Konfokal mikroskop mens bliver løbende perfunderet med ekstracellulære løsning indeholdende forskellige stimuli. Konfokal billeder der spænder over 50 µm af holmen er erhvervet som time-lapse optagelser ved hjælp af en fast-resonant scanner. Fusion af insulin granulat med plasma membran kan følges over tid. Denne procedure også giver mulighed for at teste et batteri af stimuli i en enkelt eksperiment, er kompatibel med både mus og menneskelige Holme, og kan kombineres med forskellige farvestoffer for funktionel billeddannelse (fx, membran potentielle eller cytosole calcium farvestoffer).
Introduction
Insulin er produceret af beta-celler i pancreas Holmen, og det er et centralt regulator af glukose metabolisme1. Død eller dysfunktion af betaceller forstyrrer glukose homøostase og fører til diabetes2. Insulin er pakket i tætte-core granulat, der er udgivet i en Ca2 +-afhængige måde3. Belyse, hvordan insulin granulet exocytose reguleres er afgørende for fuldt ud at forstå hvad bestemmer insulinsekretion og åbner nye muligheder for identifikation af nye terapeutiske mål for behandling af diabetes.
Insulin exocytose er blevet grundigt undersøgt, brug af elektrofysiologiske tilgange, såsom membran kapacitans målinger og mikroskopiske tilgange i kombination med fluorescerende molekyler. Membran kapacitans målinger har god tidsmæssige opløsning og tillade enkelt celle optagelser. Men ændringer i kapacitansen afspejle netto overflade af cellen og ikke fange enkelte fusion begivenheder eller skelne insulin granulet fusion fra andre ikke-insulinkrævende sekretoriske vesikler3. Mikroskopiske tilgange, såsom to-foton eller total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi i kombination med fluorescerende sonder og vesikel cargo proteiner, give yderligere detaljer. Disse teknikker fange enkelt exocytotic begivenheder og også de præ- og post exocytotic faser og kan bruges til at studere exocytotic mønstre i populationer af celler3.
Fluorescerende journalister kan være af følgende tre typer: 1) ekstracellulære, 2) cytoplasmatisk eller 3) vesikulære. 1) ekstracellulære reportere er polar røbestoffer (fx, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer gule, pyranine), der kan indføres gennem det ekstracellulære miljø4. Brugen af polar røbestoffer giver mulighed for undersøgelse af fusion pore i en population af celler og indfanger forskellige intercellulære strukturer såsom blodkar. De rapporterer imidlertid ikke på vesikel cargo adfærd. 2) cytoplasmatisk reportere er fluorescerende prober koblet til membran-associerede proteiner, der står over cytoplasmaet og er involveret i docking og exocytose. Eksempler omfatter medlemmer af opløselige N– ethylmaleimide-følsomme faktor vedhæftet fil protein receptor (SNARE) familie, der er brugt med succes i neurovidenskab for at studere neurotransmitter frigivelse5. Sådanne proteiner har flere partnere, bindende og ikke insulin-granul specifikke. 3) vesikulære reportere er fluorescerende sonder smeltet til vesikulære cargo proteiner, der giver mulighed for undersøgelse af fragt-specifikke vesikel adfærd. Insulin-granul last proteiner omfatter insulin, c-peptid, Holmen amyloid polypeptid og NPY blandt andet6,7. NPY er kun til stede i insulin indeholdende granulat og udgives sammen med insulin, hvilket gør det en fremragende partner for en fluorescerende reporter8.
Fusion af forskellige fluorescerende proteiner til NPY har været tidligere ansat til at studere forskellige aspekter af exocytose i neuroendokrine celler, såsom kravet om specifikke synaptotagmin isoformer9,10 , og hvordan den tidsforløb for frigivelse afhænger af actin cytoskelettet og myosin II11,12. I denne undersøgelse, vi valgte pHluorin som de fluorescerende reporter, som er en modificeret normal god landbrugspraksis, der er ikke-fluorescerende på sure pH-værdi inde tæt kerne granulat men bliver smukt fluorescerende ved udsættelse for neutral ekstracellulære pH13. Modne insulin granulat har en sur pH under 5,5. Når granulet sikringer med plasma membran og åbner, udsat sin last neutral ekstracellulære pH-værdi på 7,4, der tillader anvendelse af pH-følsom proteiner pHluorin som reporter7,14.
PH følsomme karakter af pHluorin og selektiv udtryk for NPY i insulin granulat, kan NPY-pHluorin fusion konstruktion bruges til at studere forskellige egenskaber for insulin granulet exocytose. Viral levering af fusion konstruktion sikrer høj Transfektion effektivitet og virker på primære beta celler eller cellelinjer og isolerede småøer. Denne metode kan også bruges som en retningslinje for at studere exocytose i enhver anden celletype med NPY-holdige vesikler. Det kan også kombineres med enhver transgene musemodel til at undersøge virkningerne af visse betingelser (knockdowns, overekspression, etc.) på exocytose. Denne teknik er tidligere blevet brugt til at karakterisere rumlige og tidsmæssige mønstre af granulet insulinsekretion i beta cellepopulationer i menneskelige Holme15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskript beskriver en teknik, der kan bruges til at visualisere exocytose af insulin granulat i beta celler i intakt i bugspytkirtlen Holme af Konfokal mikroskopi. Det bruger NPY-pHluorin som fluorescerende reporter klonet i adenovirus for at sikre en høj Transfektion effektivitet.
Selv om metoden var meget effektive i vores hænder, det kan kræve nogle ændringer, der primært afhænger af to parametre: 1) kvaliteten af holmen forberedelse, og 2) titer af viral lager med optimering …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Marcia Boulina fra DRI imaging core facilitet for hjælp med mikroskoper. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 og R56 DK084321 (AC).
Materials
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
Riferimenti
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?. Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
