이 프로토콜 절연, 문화, 및 석 회화의 쥐 파생 밸브 중간 셀의 calcific 대동맥 밸브 질환 (CAVD)의 높은 생리 적 체 외에서 모델에 설명합니다. 이 쥐 모델의 착취 셀 및 분자 메커니즘이 복잡 한 병 적인 과정을 기초에 CAVD 연구를 촉진 한다.
Calcific 대동맥 밸브 질환 (CAVD) 대동맥 밸브 전단의 진보적인 두껍게 특징 이다. 그것은 노인 및 끝 단계 신장 질병 (ESRD) 환자, 일반적으로 hyperphosphatemia와 아 고통에서 자주 발견 하는 조건이 다. 현재,의 진행을 막을 수 없습니다 약물 요법이 있다. 이 병 적인 과정의 기반이 되는 메커니즘은 불분명 남아 있다. 대동맥 밸브 전단 밸브 중간 셀 (피해자)는 VECs 사이 대동맥 cusps의 외부 표면에 얇은 층의 밸브 내 피 세포 (VECs)로 구성 된다. 쥐 모델의 사용에는 vivo에서 physiopathological 혈 청 인산 (Pi) 및 hyperphosphatemia와 아에서 고통 받는 환자의 칼슘 (Ca) 수준에 따라 소성 석 회화의 생체 외에서 연구를 수 있습니다. 설명된 프로토콜 세부 순수한 쥐 빅 인구의 빅 표시자의 식에 의해 표시 된 대로: 알파-부드러운 근육 걸 (α-SMA) vimentin 및 조직 성장 인자 베타 (TGFβ) 1과 2, 그리고 차별화 (CD) 31, 한 VEC의 클러스터의 부재 표식입니다. 이러한 피해자를 확대 하 여 연구 하 고 해명 CAVD underpinning 키 중재자 생화학, 유전, 및 이미징 연구를 수행할 수 있습니다.
건강 한 관상동맥 밸브는 밸브의 개폐 중 기계적 스트레스의 분포는 똑같이 apportioned 세 전단지의 구성 됩니다. 밸브 전단은 3 개의 명료한 층의 정의 구조: fibrosa, spongiosa, 및 ventricularis, 어떤 집 우위 한 세포 유형으로 중간 셀 (피해 자들은) 밸브. 이러한 3 개의 계층 밸브 내 피 세포 (VECs)1의 두 침대 사이 끼워 넣으면 됩니다.
피해자의 Calcific 대동맥 밸브 석 회화 (CAVD), 서방 세계에서 가장 일반적인 심장 밸브 질병 진행에서 중요 한 역할을 한다. CAVD은 적극적으로 판 막 병 조직과 그 주변 microenvironment에 의해 규제 진보적인 조건으로 설명 되어 있습니다. 세포질 변화는 처음 거리 두껍게, 그리고 결국 대동맥 밸브 전단의 광범위 한 석 회화 발생할. 이 다음 중요 한 관상동맥 밸브 협 착 증에 지도 하 고 궁극적으로, 왼쪽 심 실 유출 방해2, 떠나는 유일한 치료로 수술 밸브 교체.
CAVD의 이상 복잡 하지만 생리 뼈 강화 작용3비슷한 메커니즘을 공유 합니다. 연구의 숫자 osteogenic 트랜스-차별화 및 석 회화4,5을 피해자의 능력을 보여 준, 하는 동안이 과정을 underpinning 메커니즘은 아직 완전히 해명 될 강조는 모델을 실현 하 고 관련 생체 외에서 CAVD의 중요 한 요구 사항입니다.
실험실 수로 이전 작업, 돼지와 소 모델에서 피해자를 고립 된 성공적으로 있으며 조건6,,78석 회화에서이 세포 배양. 이러한 모델에 관상동맥 밸브의 큰 크기로 인해 효소 소화를 통해 세포의 고립 세포의 순수한 인구 생성에 매우 효과적인 되었습니다. 그러나,이 모델은 대형 동물 종에 대 한 분자 도구의 한정 된 가용성으로 인해 제한 수 있습니다. 대조적으로, 설치류 모델 상대적으로 낮은 비용, 유전자 조작에 대 한 잠재력 및 분자 도구를 쉽게 사용할 수의 광범위 한 배열 유리한 유지. 그러나, 작은 동물 모델에서 피해자의 격리 하지 널리 채택 된다, 작은 조직 샘플을 작업할 때 발생 하는 어려움의 가능성이 결과입니다.
이 상세한 프로토콜 쥐 피해자의 직접 격리에 대 한 포괄적인 방법을 보고합니다. 밸브, 일련의 효소 소화 다음의 주의 해 부에 의해 피해자는 절연 고 실험 기법, 셀 문화, 석 회화, 및 진 식 등의 다양 한 고용 될 수 있습니다. CAVD의 모델 관련성이 높은 생체 외에서 이 의심할 여 지 없이이 병 적인 과정의 우리의 지식을 증가에 필수적인 기여를 하게된다.
이 상세한 프로토콜 기본 쥐 피해 자들은, 효소 소화를 통해 쥐 심장 밸브에서 이러한 셀의 사용의 수집에 대 한 실제적인 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 더 지원 하 고 관상동맥 밸브 석 회화13연구 모델 생체 외에서 이전에 보고 된 쥐의 사용을 확장 합니다. 대동맥 밸브에서 피해자의 격리 이웃 VECs에서 오염에 대 한 가능성을 소개합니다. 그러나, 우리의 면역 형광 검사 데이터 초기 소화 단계 고립 된 세포를 내 피 세포 마커, CD31 부정적인 렌더링 VECs 제거 충분 한지 확인 합니다. 또한, α-SMA 얼룩 확인는 피해자의 활성화 형은 석 회화12필요 합니다.
빅 격리 이전에 보고 된 큰 동물 모델6,,78. 그러나, 이러한 종 다운스트림 연구로 전 세계 실험실에서 그들의 제한 된 액세스에 사용할 수 있는 제한 된 유전 및 분자 도구에 의해 제약 됩니다. 반면, 이러한 도구를 쉽게 사용할 수 있는 설치류에 따라서 능력을 분리 쥐 파생 된 피해자 수는 큰 실험 설계 용량 잘 설립 있습니다. 젊은 쥐에서 피해자의 사용 또한 세포는 상대적으로 더 오래 된 쥐, 따라서 더 많은 세포를 더 적은 동물이 요구 보다 증식을 의미 합니다. 마우스는 쉽게 액세스할 수, 하지만 쥐 때문 특히 작은 마음, 격리 하는 데 기본 마우스의 피해자 더 많은 시간이 소요 될 것 이라고 하 고 상당히 많은 동물 쥐 모델 셀의 동일한 수익률을 격리 하는 데 필요한 것입니다.
이 기술된 접근의 중요 한 이점은 피해 자들은 야생 종류와 유전자 변형 쥐 뿐만 아니라 심혈 관 질환과 밸브 상해의 쥐 모델에서 일시적으로 고립 될 수 있다 이다. 쥐 모델을 사용 하 여 필요 동물의 더 큰 수 대규모 실험, 따라서 동물 사용을 줄이기 위해, 그것을 잘 특징은 일단 셀 라인 생산 주 쥐 피해 자들은 변형 될 수 있다.
CAVD의 심각한 임상 의미 널리 인식 하 고, 하는 동안 근본적인 원인이 메커니즘은 아직 확인할 수 있다. 또한, 효과적인 약물 치료를 방지 하 고 잠재적으로 관상동맥 밸브 석 회화 치료 수 있습니다에서 사용할 수 있습니다 선물. 석 회화 조건 아래 피해자의 문화는 그러므로 CAVD의 관련성이 높은 생체 외에서 모델을 제공 합니다. 우리는 높은 Ca 및 Pi 수준 osteogenic 유전자 마커 Msx2, Alpl및 Phospho1의 표현에 수 반하는 증가 가진 고립 된 쥐 피해자의 체 외에 석 회화 유도 보여. 그것은 널리 이러한 마커 혈관 석 회화14,,1516의 병 적인 프로세스와 관련 된 설립. 우리의 데이터는 따라서 쥐 피해 자들은 중간 석 회화에 문화는 관상동맥 밸브 석 회화 시험관을 공부 하는 적절 한 모델을 보여준다. 실제로, 우리의 실험실에서 최근 연구는 캘리포니아 빅 파생 매트릭스 소포17의 Annexin VI 농축을 통해 관상동맥 밸브 석 회화 촉진 입증이 모델을 활용 하 고 있다.
쥐 피해 자들은 그들의 효율적인 특성을 사용 하 여의 혜택에도 불구 하 고 몇 가지 제한이 여전히 존재 한다. 첫째, 쥐 밸브 내 빅 인구의 크기는 매우 작습니다, 그리고 따라서 많은 동물 광범위 한 생체 외에서 연구에 대 한 충분 한 셀 번호를 생성 하기 위해 필요. 그러나, 그것은 불멸 하 게 밸브 중간 셀 라인, 최근에18, 우리가 보고 하 고 이후 주 문화를 고용 확인 하 고 이러한 연구 결과 확장 사업 예비 연구 하 여이 제한을 극복 하기 위해 가능 하다.
요약, 설명된 방법 성공적인 절연, 문화, 및 기본 쥐 수 있습니다 이후에 평가 분석을 포함 한 생 화 확 적인 분석 실험 단백질 및 RNA 분석의 다양 한을 사용 하 여 피해자의 석 회화를 설명 합니다. 이 모델 CAVD에서 생체 외에서조사 하는 안정적이 고 편리한 시스템 고이 파괴적인 질병에 대 한 책임 분자 메커니즘을 조사에 대 한 유용한 도구를 제공 합니다.
The authors have nothing to disclose.
CD31 항 체 사용 박사 카 렌 탄, 에든버러 대학에서에서 관대 한 선물 했다. 이 연구는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC)는 연구소 전략적 프로그램 그랜트 (BB/J004316/1;의 형태로 자금에 의해 지원 되었다 BBS/E/D/20221657) (누구와 CF)는 연구소 경력 경로 친목 BB/F023928/1 (누구), 그리고 재학 BBSRC 경우 재학 BB/K011618/1 (LC)를 통해 자금.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
Spring curved (14 cm) | World Precision Instruments | 14112 | Autoclave before use. |
Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
SuperFine Vannas scissors (3 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 501778 | Autoclave before use. |
Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
Triton X100 | Sigma | X100 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Camera set up for Alizarin red images: | |||
Camera | Nikon D800 | ||
Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED |