Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren<em> Drosophila</em> Motor Neuron Degeneration

Summary

Hier beschreiben wir eine einfache und weit zugängliche Methode, um die Segmentnerven in Drosophila- Larven zu verletzen, um die Neurodegeneration von motorischen Neuronen an der neuromuskulären Kreuzung (NMJ) der dritten Larven der Larven zu visualisieren und zu quantifizieren.

Abstract

Die Degeneration von Neuronen tritt während der normalen Entwicklung und als Reaktion auf Verletzungen, Stress und Krankheit auf. Die zellulären Merkmale der neuronalen Degeneration sind bei Menschen und Invertebraten bemerkenswert ähnlich wie die molekularen Mechanismen, die diese Prozesse antreiben. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster , bietet einen mächtigen, aber einfachen genetischen Modellorganismus, um die zellulären Komplexität neurodegenerativer Erkrankungen zu untersuchen. Tatsächlich haben etwa 70% der krankheitsassoziierten menschlichen Gene ein Drosophila- Homolog und eine Fülle von Werkzeugen und Assays wurden beschrieben, indem sie fliegt, um menschliche neurodegenerative Erkrankungen zu untersuchen. Genauer gesagt hat sich der neuromuskuläre Knotenpunkt (NMJ) in Drosophila als wirksames System erwiesen, um neuromuskuläre Erkrankungen zu untersuchen, da die Fähigkeit besteht, die strukturellen Verbindungen zwischen dem Neuron und dem Muskel zu analysieren. Hier berichten wir über einen in vivo motorischen Neuronenverletzungsassay in DrosophilaReproduzierbar neurodegeneration am NMJ um 24 h induziert. Mit dieser Methodik haben wir eine zeitliche Abfolge von zellulären Ereignissen beschrieben, die zu einer motorischen Neuronendegeneration führen. Die Verletzungsmethode hat vielfältige Anwendungen und wurde auch verwendet, um spezifische Gene zu identifizieren, die für die Neurodegeneration erforderlich sind, und die Transkriptionsreaktionen auf neuronale Verletzungen zu zerlegen.

Introduction

Neuronale Degeneration tritt während der normalen Entwicklung auf und kann durch den natürlichen Alterungsprozess, die Verletzung, den Stress oder die Krankheitszustände verursacht werden. Drosophila melanogaster , die gemeinsame Fruchtfliege, bietet einen einfachen und leistungsfähigen Modellorganismus, um die Neurodegeneration aufgrund der bemerkenswerten Ähnlichkeiten in den molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Degeneration von Neuronen antreiben. Diese Ähnlichkeiten werden durch die Tatsache hervorgehoben, dass etwa 70% der krankheitsassoziierten menschlichen Gene ein Drosophila- Homolog haben. ¹ Darüber hinaus wurden zahlreiche Assays und technologische Werkzeuge zur Untersuchung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen in Drosophila entwickelt und genutzt. ^{2 , 3} Innerhalb von Drosophila erlaubt der neuromuskuläre Knotenpunkt (NMJ) die Analyse sowohl der zellulären als auch der elektrophysiologischen Eigenschaften und hat sich als ein wichtiges System erwiesen, um die neuromuskuläre Erkrankung aufgrund des sichtbaren n zu untersuchenEuron-Muskel-Verbindungen. ² In dieser Studie beschreiben wir einen in vivo Neuronenverletzungsassay in Drosophila- Larven, der die reproduzierbare Verletzung der segmentalen Nerven ermöglicht. Diese Motoneuron-Verletzung führt zu einer zeitlichen Abfolge von zellulären Ereignissen, die zu einer Neurodegeneration bei der NMJ 24 h nach der Verletzung führen. Die Fähigkeit zur reproduzierbaren Verletzung von Motoneuronen, die zu einer Neurodegeneration führen, hat vielfältige Anwendungen, wie die Identifizierung spezifischer Gene, die für den degenerativen Prozess erforderlich sind, die Sezierung von Transkriptionsreaktionen auf neuronale Verletzungen und die Analyse von schützenden Signalkaskaden. ^{4 , 5 , 6} Diese Methode wurde auch in Kombination mit Mikrofluidik verwendet, um neuronale Degeneration und Regeneration bei lebenden Tieren zu untersuchen. ⁷

Wir verwenden einen etablierten quantitativen Assay, um den motorischen Neuron degenerat zu untersuchenIon bei der Drosophila NMJ nach mechanischer Verletzung. Dieser Assay basiert auf der Tatsache, dass der Verlust der präsynaptischen Membran und der Proteine ​​der Zerlegung des subsynaptischen Retikulums (SSR) vorangeht, das durch die postsynaptischen Muskelmembranfalten charakterisiert ist. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} Dieser Assay erlaubt die Quantifizierung von "synaptischen Abdrücken", bei denen das vor-synaptische Neuron die Verbindung zum benachbarten postsynaptischen Muskel verloren hat. Der degenerative Prozeß hat sich in der Larvenentwicklung ¹² als fortschrittlich erwiesen und kann nicht durch eine veränderte Synapsenentwicklung oder Keimung erklärt werden. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} Die AnzeigeVorteil der mechanischen Verletzung über bereits vorhandene Mutationen ist, dass es die Sezierung der zeitlichen Abfolge von zellulären Ereignissen ermöglicht, die zur Neurodegeneration am NMJ führen. ¹³

Protocol

1. Vorbereitung von Reagenzien und Geräten 1 × Dissektionspuffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl 2 , 20 mM MgCl 2 , 10 mM NaHCO 3 , 115 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES, pH 7,2) herstellen. 40 Phosphat-gepufferte Saline (PBS) zubereiten. Vorbereitung von 1x PBT mit 1x PBS mit 0,01% Triton X-100. Fruchtsaft-Agarplatten vorbereiten. 14 Mischen Sie 30 g Agar in 700 ml H 2 O und Autoklav. 0,5 g Methylp…

Representative Results

Mit dem hier vorgestellten Verfahren haben wir gezeigt, dass mechanische neuronale Verletzungen eine zeitliche Dissektion von neurodegenerativen Ereignissen ermöglichen. 14 , 18 Die Reihenfolge der Ereignisse wurde zuvor charakterisiert und beginnt mit einer sofortigen Unterbrechung des Zytoskeletts, gefolgt von axonalen Menschenhandlungsdefekten, einer Anhäufung von ubiquitinierten Proteinen und anschließender Neurodegenerati…

Discussion

Die hier beschriebene neuronale mechanische Verletzung kann hier verwendet werden, um Verletzungen / Stress in den Segmentnerven der Drosophila- Larven zu induzieren. ^{4 , 5 , 6 , 14} Diese experimentelle Technik wurde bisher verwendet, um die zeitliche Abfolge von Ereignissen, die zur Neurodegeneration führen, zu sezieren, sowie die Transkriptionsänderungen in den motorischen Neuronz…

Materials

Micro-dissecting scissors	Fine Science Tools	15000-08
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30	Some people prefer size 3, while others prefer size 5
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Some people prefer size 3, while others prefer size 5
CO2 Air Tank	Tech Air	UN 1013	Various tank sizes can be purchased/
CO2 Anesthetizing Apparatus	Genesee Scientific	59-114
Stainless-steel pins, size 0.1	Fine Science Tools	26002-10
SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent	Dow Corning	3097358-1004	To pour dissecting plates
Bouin's Solution	Sigma	HT 10132-1L	Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA
4% Paraformaldehyde in PBS	Affymetrix	FLY-8030-20	Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA
Dissecting Stereo MIcroscope	AmScope	SM-1BZ
Light Source	AmScope	HL150-AY-220V
anti- nc82 antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82-s
anti-discs large antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	AF3
Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase	Jackson Immunoresearch	123-545-021; 123-585-021; 123-605-021	One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647
Flystuff Grape Juice Agar Premix	Genesee Scientific	47-102
Microscope slides	Genesee Scientific	29-101
Glass Coverslips	Fisher Scientific	12-545-87
Thermo Scientific Nalgene Utility Box	Fisher Scientific	03-484C	Used to create humid chamber for larval recovery