लाइमिनिन 521 मैट्रिक्स का उपयोग करने वाले मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का एकीकरण फ्री डेरीवेशन
Summary
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (एचईपीएस) कोशिकाओं के मजबूत व्युत्पन्न त्वचीय फाइब्रोब्लैस्ट्स के गैर-एकीकृत सेंडाइ वायरस (सीएवी) वेक्टर मध्यस्थताग्रस्त reprogramming का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। एचईपीएस कोशिका के रखरखाव और क्लोनल विस्तार को पुन: संयोजक मानव लैमिनिन 521 (एलएन -521) मैट्रिक्स और आवश्यक ई 8 (ई 8) मध्यम के साथ एक्सो मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति शर्तों का उपयोग किया गया था।
Abstract
एक्सो-फ्री और पूरी तरह से परिभाषित स्थितियां समरूप इंसान प्रेरित प्लूइपोटेंट स्टेम (एचपीएस) कोशिकाओं के मजबूत और प्रजनन योग्य पीढ़ी के प्रमुख पैरामीटर हैं। फीडर कोशिकाओं या अपरिभाषित मैट्रिक्स पर हायपीएस कोशिकाओं के रखरखाव बैच के भिन्नता, रोगजनक प्रदूषण और प्रतिरक्षा प्रत्यारोपण के जोखिम के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। परिभाषित पुनः संयोजक मानव लैमिनिन 521 (एलएन -521) मैट्रिक्स का उपयोग एक्सनो-फ्री और परिभाषित मीडिया फॉर्म्युलेशन के साथ में परिवर्तनशीलता को कम करता है और हायपीएस कोशिकाओं की लगातार पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। सेंडाइ वायरस (एसईवी) वेक्टर एक गैर-एकीकृत आरएनए आधारित प्रणाली है, इस प्रकार जीनोम अखंडता समेकन करने वाले वैक्टर पर संभावित विघटनकारी प्रभाव से जुड़े चिंताओं को खारिज कर सकते हैं। इसके अलावा, इन वैक्टर ने त्वचीय तंतुकोशिकाओं के पुनर्प्रक्रमण में अपेक्षाकृत उच्च दक्षता का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, कोशिकाओं के एंजाइमेटिक एकल कोशिका उत्कीर्णन ने स्टेम सीए के पर्याप्त अनुभव के बिना एचपीएस कोशिकाओं के सजातीय रखरखाव की सुविधा प्रदान कीसंस्कृति होगी यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो बड़े पैमाने पर परीक्षण किया गया है और प्रजननशीलता और उपयोग में आसानी पर ध्यान देने के साथ विकसित किया गया है, जिससे फाइब्रोब्लैस्ट्स से परिभाषित और एक्सनो-मुक्त मानव एचपीएस कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत और व्यावहारिक तरीका प्रदान किया गया है।
Introduction
ताकाहाशी एट अल द्वारा हायपीएस सेल लाइनों की पहली व्युत्पत्ति के बाद से 1 , 2 , हायपीएस कोशिकाओं ने बीमारी मॉडलिंग, दवा की खोज के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान किया है और पुनर्योजी औषधि 3 में सेल थेरेपी बनाने के लिए स्रोत सामग्री के रूप में। हायपीएस कोशिका संस्कृति लंबे समय तक फाइब्रोब्लास्ट फीडर कोशिकाओं 4 , 5 या मैटिगल 6 पर और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) वाले मीडिया फॉर्मूलेशन के साथ सह-संस्कृति पर निर्भर रही है। बैच-टू-बैच वेरिएंस इन संस्कृति शर्तों की अपरिभाषित प्रकृति का एक सामान्य परिणाम है, जिसके परिणामस्वरूप अप्रत्याशित रूप से भिन्नताएं होती हैं, जो इन प्रोटोकॉल 7 की अविश्वसनीयता के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता है। परिभाषित माध्यम जैसे कि आवश्यक 8 (ई 8 ) 8 और परिभाषित सेल संस्कृति मैट्रिक्स उदाहरण के लिए एलएन -521 9 , की अनुमति देंउच्च प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए और समृद्ध हायपीएस कोशिकाओं 7 , 8 , 9 , 10 की मजबूत पीढ़ी और रखरखाव में सहायता।
एकीकरण के मुक्त पुनर्रोग्राम तकनीक का विकास एक छलांग आगे है। मूल रूप से, रिप्रोग्रैमिगिंग रेट्रोवायरल वैक्टर पर निर्भर था जो जीनोमिक अखंडता 11 पर विघटनकारी प्रभावों के साथ जीनोम में बेतरतीब ढंग से एकीकृत हुआ था। रिप्रोग्रागमिंग पद्धतियों में अग्रिमों में आरएनए आधारित वैक्टर के विकास शामिल हैं। आरएनए वैक्टर के पास डीएनए आधारित रिप्रोग्रामिंग विधि पर एक फायदा है क्योंकि जीनोमिक पुनर्संयोजन के जरिए अनपेक्षित एकीकरण 12 संभव नहीं है। एसईवी वैक्टर डीएनए चरण 11 के बिना अकेले फंसे हुए आरएनए के माध्यम से बहिर्जात कारकों के उच्च और क्षणिक अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं सेव द्वारा वितरित पुनःप्रोग्रामाकरण वैक्टरसेल के विस्तार के दौरान पतला हो जाता है और अंततः संस्कृति से बहाल हो जाता है जिससे कि पुनर्रोग्रामिंग के एक पैरों के छद्म मुक्त तरीका उपलब्ध हो सके। इसके बाद, प्लुरिपोटेंसी का रखरखाव प्लुरिपोटेंसी जीन के अंतर्जात अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है 2 ।
जैसा कि अग्रणी एचईपीएस सेल आधारित चिकित्सा नैदानिक परीक्षणों में बढ़ने की शुरुआत कर रहे हैं, मानकीकृत बैचों की मांग, पुनरुत्पादन और सुरक्षा 13 को संबोधित करने के लिए आवश्यक मुद्दों हैं। इसलिए, पशु उत्पत्ति के उत्पादों से बचा जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ज़ीनोजेनिक उत्पादों का उपयोग गैर-हानिकारक रोगजन संदूषण के जोखिम से जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, पशु व्युत्पन्न संस्कृति घटकों की उपस्थिति में सुसंस्कृत कोशिकाओं को गैर-विषम सिएलिक एसिड को कोशिका झिल्ली में शामिल करने के लिए दिखाया गया है जो व्युत्पन्न कोशिकाओं immunogenic 14 को प्रस्तुत करने की धमकी देता है। इसलिए, किसी भी भविष्य के क्लिनिकल व्यवसायों के लिए एक्सनोजेनिक उत्पादों को खत्म करने की आवश्यकता जरूरी है। यह प्रोटोकॉल Xe लागू करता हैएचपीपीएस कोशिकाओं के रखरखाव में कोई मुक्त और परिभाषित संस्कृति कोशिकाओं को नैदानिक अनुपालन के करीब लेती है।
यह प्रोटोकॉल एक सुसंगत, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और आसानी से उपयोग करने वाली विधि का वर्णन करता है जो फाइब्रोब्लैस्ट से मानकीकृत हाईपीएस कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। यह स्थापित hiPS कोशिकाओं के रखरखाव के लिए उपयोगकर्ता-अनुकूल संस्कृति प्रणाली भी प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग Karolinska Institutet में स्वीडिश राष्ट्रीय मानव आईपीएस कोर सुविधा में 300 से अधिक hiPS सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए किया गया है, जिनमें से कुछ पंक्तियों को पहले 15 , 16 का वर्णन किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का अपेक्षित परिणाम कई क्लोनली व्युत्पन्न हायपीएस सेल लाइनों की सफल पीढ़ी है। महत्वपूर्ण रूप से, यहां वर्णित स्थापित hiPS कोशिकाओं के रखरखाव और विस्तार के लिए विधि विश्वसनीय है और स्टेम सेल…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एसएसएफ़ (बी 13 -0074) और विनोवा (2016-04134) फंडिंग एजेंटों द्वारा समर्थित था।
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
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