Integración Derivación Gratuita de Células Madre Pluripotentes Inducidas Humanas Usando Laminin 521 Matrix
Summary
derivación robusta de las células inducido por el hombre pluripotentes madre (HIPS) se logró mediante el uso de no-integración de virus Sendai (SeV) vector reprogramación mediada de fibroblastos dérmicos. el mantenimiento de células caderas y la expansión clonal se realizó utilizando condiciones de cultivo libre de xeno y definidos químicamente con laminina humana recombinante 521 (LN-521) de matriz y esencial E8 (E8) Medium.
Abstract
Las condiciones sin Xeno y completamente definidas son parámetros clave para la generación robusta y reproducible de células de vástago pluripotentes inducidas por humanos (HiPS) homogéneas. El mantenimiento de células hiPS en células alimentadoras o matrices indefinidas son susceptibles a variaciones en lotes, contaminación patógena y riesgo de inmunogenicidad. La utilización de la matriz de laminina 521 (LN-521) humana recombinante definida en combinación con formulaciones de medios sin xeno y definidas reduce la variabilidad y permite la generación consistente de células hiPS. El virus Sendai (SeV) vector es un no-integrar RNA-basado en el sistema, evitando así las preocupaciones asociadas con el potencial efecto disruptivo sobre la integridad del genoma integrar vectores pueden tener. Además, estos vectores han demostrado una eficacia relativamente alta en la reprogramación de fibroblastos dérmicos. Además, el paso enzimático de celdas individuales facilita el mantenimiento homogéneo de las células HiPS sin experiencia previaLl cultura. Aquí se describe un protocolo que ha sido ampliamente probado y desarrollado con un enfoque en la reproducibilidad y facilidad de uso, proporcionando una manera robusta y práctica para generar definido y xeno-libre humanos hiPS células de fibroblastos.
Introduction
Desde la primera derivación de las líneas de células HiPS por Takahashi et al. 1 , 2 , HiPS células han proporcionado una herramienta útil para la enfermedad de modelado, descubrimiento de fármacos y como material de origen para la generación de terapias celulares en la medicina regenerativa [ 3] . El cultivo de células hiPS ha dependido durante mucho tiempo del co-cultivo con células alimentadoras de fibroblastos 4 , 5 o en Matrigel 6 y con formulaciones de medios que contienen suero fetal bovino (FBS). Las variaciones de lote a lote son una consecuencia común de la naturaleza indefinida de estas condiciones de cultivo, lo que resulta en variaciones impredecibles, lo que es un contribuyente importante a la falta de fiabilidad de estos protocolos 7 . El desarrollo de un medio definido tal como Essential 8 (E8) 8 y matrices de cultivo celular definidas por ejemplo LN-521 9 , permitenS para el establecimiento de protocolos altamente reproducibles y ayuda en la robusta generación y mantenimiento de células hoPS homogéneas 7 , 8 , 9 , 10 .
El desarrollo de técnicas de reprogramación libres de integración ha sido un salto adelante. Originalmente, la reprogramación dependía de los vectores retrovirales que se integraron al azar en el genoma con efectos perjudiciales sobre la integridad genómica [ 11] . Los avances en las metodologías de reprogramación incluyen el desarrollo de vectores basados en ARN. Los vectores de ARN tienen una ventaja sobre el método de reprogramación basado en el ADN como la integración no intencional a través de la recombinación genómica no es posible [ 12] . Los vectores SeV proporcionan una expresión alta y transitoria de factores exógenos a través de ARN monocatenario sin una fase de ADN 11 . Los vectores de reprogramación entregados por el SeVSe diluyen a lo largo de la expansión celular y eventualmente se desprenden del cultivo proporcionando una forma libre de reprogramación. Posteriormente, el mantenimiento de la pluripotencia depende de la expresión endógena de los genes de pluripotencia [ 2] .
Como las terapias pioneras basadas en células de HiPS están comenzando a entrar en ensayos clínicos, las demandas de lotes estandarizados, reproducibilidad y seguridad son cuestiones esenciales para abordar. Por lo tanto, deben evitarse los productos de origen animal. Por ejemplo, el uso de productos xenogénicos se ha asociado con el riesgo de contaminación no humana de patógenos. Además, se ha demostrado que las células cultivadas en presencia de componentes de cultivo derivados de animales incorporan ácidos siliacos no humanos en las membranas celulares, lo que amenaza con hacer que las células derivadas sean inmunogénicas 14 . Por lo tanto, la necesidad de eliminar los productos xenogénicos es necesaria para cualquier actividad clínica futura. Este protocolo se aplica xeNo-libre y definido en el mantenimiento de las células HiPS celdas móviles más cerca de cumplimiento clínico.
Este protocolo describe un método consistente, altamente reproducible y fácil de usar que genera células hiPS estandarizadas a partir de fibroblastos. También ofrece un sistema de cultivo de fácil manejo para el mantenimiento de las células hiPS establecidas. Este protocolo se ha utilizado para derivar más de 300 líneas celulares hiPS en la instalación nacional sueca de iPS core humano en el Instituto Karolinska, de la cual algunas líneas se han descrito previamente 15 , 16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
El resultado esperado de este protocolo es la generación exitosa de varias líneas celulares de hiPS derivadas clonalmente. Es importante destacar que el método para el mantenimiento y la expansión de las células hiPS establecidas aquí descritas es fiable y puede realizarse con poca experiencia previa de cultivo de células madre. Se sabe que el paso de células únicas enzimáticas con ROCKi junto con la matriz LN-521 mantiene las células como cariotipicamente normales, pluripotentes y fácilmente capaces de dife…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los agentes de financiación SSF (B13-0074) y VINNOVA (2016-04134).
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
References
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