Integrationsfri afledning af humane inducerede pluripotente stamceller ved anvendelse af Laminin 521 Matrix
Summary
Robust afledning af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPS) celler blev opnået ved anvendelse af ikke-integrerende Sendai virus (SeV) vektor-medieret omprogrammering af dermal fibroblaster. HiPS-cellevedligeholdelse og klonal ekspansion blev udført under anvendelse af xenofrie og kemisk definerede dyrkningsbetingelser med rekombinant human laminin 521 (LN-521) matrix og essentielt E8 (E8) medium.
Abstract
Xeno-fri og fuldt definerede betingelser er nøgleparametre for robust og reproducerbar generation af homogene humane inducerede pluripotente stamceller (hiPS) celler. Vedligeholdelse af hiPS-celler på feederceller eller udefinerede matricer er modtagelige for batchafvigelser, patogen forurening og risiko for immunogenicitet. Ved anvendelse af den definerede rekombinante humane laminin 521 (LN-521) matrix i kombination med xenofri og definerede medier formuleringer reducerer variabilitet og muliggør konsistent generering af hiPS celler. Sendai-viruset (SeV) -vektoren er et ikke-integreret RNA-baseret system, hvorved omgåelse af bekymringer forbundet med den potentielle forstyrrende virkning på genomets integritet integrationsvektorer kan have. Desuden har disse vektorer vist relativt høj effektivitet ved omprogrammeringen af dermale fibroblaster. Derudover letter enzymatisk enkeltcellepassaging af celler homogen vedligeholdelse af hiPS-celler uden væsentlig tidligere erfaring med stamcellerLl kultur. Her beskriver vi en protokol, der er blevet omfattende testet og udviklet med fokus på reproducerbarhed og brugervenlighed, hvilket giver en robust og praktisk måde at generere definerede og xenofrie humane hiPS celler fra fibroblaster.
Introduction
Siden den første afledning af hiPS cellelinier af Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-celler har tilvejebragt et nyttigt værktøj til sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og som kildemateriale til generering af celleterapier i regenerativ medicin 3 . HiPS cellekultur har længe været afhængig af co-kultur med fibroblast feederceller 4 , 5 eller på Matrigel 6 og med medieformuleringer indeholdende føtalt bovint serum (FBS). Batch-to-batch-afvigelser er en fælles konsekvens af de ubetingede karakter af disse kulturbetingelser, hvilket resulterer i uforudsigelige variationer, hvilket er en væsentlig bidragyder til disse protokolers upålidelighed 7 . Udviklingen af defineret medium, såsom essentielle 8 (E8) 8 og definerede cellekulturmatricer, for eksempel LN-521 9 , tilladerS til etablering af højt reproducerbare protokoller og hjælp til robust generering og vedligeholdelse af homogene hiPS celler 7 , 8 , 9 , 10 .
Udvikling af integrationsfri omprogrammeringsteknikker har været et spring fremad. Oprindelig var omprogrammeringen afhængig af retrovirale vektorer, som tilfældigt integreredes i genomet med forstyrrende virkninger på genomisk integritet 11 . Fremskridt i omprogrammeringsmetoder omfatter udvikling af RNA-baserede vektorer. RNA-vektorer har en fordel i forhold til den DNA-baserede omprogrammeringsmetode, idet utilsigtet integration via genomisk rekombination ikke er mulig 12 . SeV-vektorer tilvejebringer høj og forbigående ekspression af exogene faktorer gennem enkeltstrenget RNA uden en DNA-fase 11 . De omprogrammerende vektorer leveret af SeVFortyndes gennem celleudvidelse og til sidst udstødes fra kulturen, der giver en fotoprintfri måde at omprogrammere. Derefter er vedligeholdelse af pluripoten afhængig af endogen ekspression af pluripotensgenerne 2 .
Som pionerende hiPS-cellebaserede terapier begynder at bevæge sig ind i kliniske forsøg, er kravene til standardiserede batches, reproducerbarhed og sikkerhed væsentlige spørgsmål for at behandle 13 . Derfor bør produkter af animalsk oprindelse undgås. For eksempel har brugen af xenogene produkter været forbundet med risiko for ikke-humant patogenforurening. Celler, der er dyrket i nærværelse af dyreafledte kulturkomponenter, har også vist sig at inkorporere ikke-humane siliaki-syrer i cellemembraner, som truer med at gøre afledte celler immunogene 14 . Derfor er behovet for at fjerne xenogene produkter nødvendigt for fremtidige kliniske sysler. Denne protokol gælder xeIngen fri og defineret kultur i vedligeholdelsen af hiPS celler flytter celler tættere på klinisk overholdelse.
Denne protokol beskriver en konsistent, meget reproducerbar og nem at bruge metode, der genererer standardiserede hiPS-celler fra fibroblaster. Det giver også et brugervenligt kultursystem til vedligeholdelse af etablerede hiPS-celler. Denne protokol er blevet brugt til at udlede mere end 300 hiPS cellelinjer i den svenske nationale menneskelige iPS Core-facilitet ved Karolinska Institutet, hvoraf nogle linjer tidligere er beskrevet 15 , 16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Det forventede resultat af denne protokol er den vellykkede generering af flere klonalt afledte hiPS-cellelinier. Det er vigtigt, at metoden til vedligeholdelse og udvidelse af etablerede hiPS-celler her beskrevet er pålidelig og kan udføres med lidt tidligere erfaring med stamcellekultur. Enzymatisk enkeltcellepassaging med ROCKi sammen med LN-521-matrixen er kendt for at bevare cellerne som karyotypisk normale, pluripotente og let i stand til at differentiere samtidig med at man undgår induceret heterogenitet, at k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af SSF (B13-0074) og VINNOVA (2016-04134) finansieringsagenter.
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
