果蝇成人间接飞行肌的光学横截肌面积测定
Summary
我们报告的方法, 以量化肌肉面积, 这是一个间接的方法来确定肌肉质量在果蝇成人。我们通过分析强直营养不良症的果蝇模型中的间接飞行肌肉来证明我们的方法的应用。
Abstract
肌肉大量的浪费, 称为肌肉萎缩, 是一个常见的表型在果蝇模型的神经肌肉疾病。我们使用的间接飞行肌肉 (IFMs) 的苍蝇, 特别是 dorso-纵肌 (DLM), 作为实验对象, 以衡量的萎缩表型所带来的不同的遗传原因。在该协议中, 我们描述了如何将飞胸肌嵌入半薄切片, 如何获得良好的肌肉和周围组织的对比, 以及如何处理光学显微镜图像的半自动获取可量化的数据和分析.我们描述方法管道的三具体应用。首先, 我们展示了如何将该方法用于量化强直营养不良蝇模型中的肌肉退化;第二, 肌肉横截面积的测量可以帮助识别促进或防止肌肉萎缩和/或肌肉退化的基因;第三, 该协议可用于确定候选化合物是否能够显著改变由致病突变或环境触发器诱发的特定萎缩表型.
Introduction
果蝇的胸部包含两种不同种类的飞行肌肉, 它们在功能上、生理上和解剖学上截然不同。这些肌肉是: 间接飞行肌肉 (IFM), 由 dorso 纵向 (DLM) 和 dorso 腹 (DVM) 肌肉 (图 1) 和同步飞行控制肌肉1,2组成。这些肌肉共同产生飞行所需的高机械动力。IFMs 的大小、分布和 rostro 尾部配置允许对横向切片3 (图 2A) 进行简单的定位。因此, 我们选择了这些肌肉来研究果蝇的肌肉萎缩症。
图1。图的胸部的果蝇显示间接飞行肌肉 (IFMs) 安排。(左) 代表侧面视图, (右) 表示胸部的横断面。IFMs 由 Dorso 纵向 (DLM) 肌肉 (红色) 和 Dorso 腹 (DVM) 肌肉 (绿色) 组成。
组织结构的保存和对 dorso-腹侧轴方向的控制是确保正确评估肌肉横截面积的关键。为了保持肌肉结构, 我们使用了从汤姆林森et . 修改的固定混合物。4 。此外, 由于肌肉是内部组织, 因此, 由于固定混合物无法穿透靶组织, 因此,果蝇外骨骼的抗渗性是一个问题。为了规避这个问题, 我们删除了苍蝇头, 腿, 翅膀和最后两个部分的腹部创造孔, 使固定合剂进入。作为固定协议的一部分, 我们包括使用锇毒气 (OsO4)5进行治疗, 因为它能够修复脂肪, 包括甘油三酯, 因此被广泛使用。OsO4保留大多数结构非常好, 特别是在细胞学级别, 同时提供与图像的对比度。固定后,果蝇胸膛嵌入在树脂中进行横向半薄切片 (1.5 µm)。为改善对比, 组织可以另外染色甲苯胺蓝。完全胸膛的图像是在10X 和肌肉区域被量化的 binarizing 图像 (等维度) 和量化百分比的像素对应的肌肉组织 (黑色像素) 的总和, 与 ImageJ 软件。
在本议定书中介绍的 OsO4和戊二醛溶液浓度的增加, 对组织制备和固定混合物的修改, 使肌肉组织得以独特的保存。这是因为该协议避免了组织的退化和变形, 使样品的后分析更可靠, 即使在高度萎缩的情况下与神经肌肉退行性疾病, 如强直营养不良 (DM) 有关。在更常见的形式, DM 类型 1, 这种罕见的遗传紊乱是由扩大 CUG 重复在强直营养不良蛋白激酶(DMPK) 转录。突变 DMPK rna 聚集形成 ribonuclear 病灶, 它能封存 Muscleblind 核 RNA 结合蛋白 (MBNL1-3;果蝇)6中的 Muscleblind。我们通过在肌球蛋白重链启动子 (Mhc-Gal4) 下表达 250 CTG 重复, 生成了一种强直营养不良的果蝇模型。模型苍蝇是不能飞的, 典型的 “上升的翅膀” 表型和严重的肌肉萎缩, 在他们的 IFMs (图 2B)。以前在我们实验室进行的研究表明, IFMs 的肌肉面积的测定是一种可靠的方法来量化不同化学或遗传修饰剂的肌肉萎缩的影响, 这些模型苍蝇7。举例来说, 在飞行中表达 250 CTG 重复的异构体 C 在肌肉中的过度表达, 实现了肌肉区域的抢救, 因为螯合被封存的损耗是 DM1 发病机制8 (图 2C) 的触发因素。肌肉区域也获救后喂养 DM 模型苍蝇与 Abp1, 一个 hexapeptide 与证明 anti-DM1 活动9 (图 2D)。
图2。树脂嵌入成人胸膛 dorsoventral 段的量化。(A D) 间接飞行肌肉的果蝇与指定的相关基因型。(A) 控制苍蝇 (yw)。(B) 在肌肉中250非编码 CTG 重复的表达 (无人参与-ctg (250) x) 导致 DLMs 中肌肉面积的减少与控制苍蝇相比. (C) 这种肌肉萎缩表型是通过过度表达 Muscleblind (MblC) (无人飞机-ctg (250) x 无人) 和 (D) 喂养模型苍蝇与 hexapeptide Abp1 (无人飞机-ctg (250) x Abp1)。在所有图像中, 背侧位于顶部。转基因是用肌球蛋白重链启动子 (Mhc)-Gal4 驱动肌肉。(E) 相对于对照蝇的肌肉面积百分比进行量化, 证实差异很大。直方图显示的意思是 S.E.M.p< 0.01 和 * p < 0.05 (Student´s t 测试)。刻度条: 200 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
本文所报道的方法将对研究肌肉发育、维持和衰老、疾病病理学和药物检测的研究者们感兴趣, 因为它提供了有关肌肉组织对内源和外在因素的反应的可靠信息。
Protocol
Representative Results
Discussion
已证明,果蝇是研究人类神经肌肉疾病的有用模型7,10,11, 包括强直白斑, 其特点是外观肌肉萎缩。这里提出的协议是一个有用的工具, 以量化的肌肉退化造成的发病或进展的某一特定疾病的苍蝇模型。例如, 通过对不同年龄的苍蝇进行这种分析, 也可以追踪和量化肌肉纤维的变性。
该协议中有关键步骤?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢翻译基因组小组成员和凯瑟琳·汉森的反馈和对该协议的改进。这个项目是与研究赠款 SAF2015-64500-R, 其中包括欧洲区域发展基金, 授予 R. A 由 Ministerio de Economia y Competitividad。
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
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