Détermination de zone optique transversale musculaire des Muscles de vol Indirect adulte de Drosophila Melanogaster

Summary

Nous présentons une méthode pour quantifier la zone musculaire, qui est une méthode indirecte pour déterminer la masse musculaire chez les adultes de la drosophile . Nous avons démontré que l’application de notre méthodologie en analysant le vol indirect les muscles dans un modèle drosophile de la maladie de la dystrophie myotonique.

Abstract

Masse musculaire, perdre, connu comme l’atrophie musculaire, est un phénotype commun dans des modèles de drosophile de maladies neuromusculaires. Nous avons utilisé les muscles de vol indirect (SIFM) de mouches, spécifiquement les muscles dorso-longitudinal (DLM), comme l’expérimental objet mesure le phénotype atrophique provoqué par des causes génétiques différentes. Dans ce protocole, nous décrivons comment incorporer des muscles thorax mouche pour la coupe fine semi, comment obtenir un bon contraste entre le muscle et le tissu environnant et comment traiter les images de microscope optique pour acquisition semi-automatique des données quantifiables et analyse. Nous décrivons trois applications spécifiques de l’oléoduc méthodologique. Tout d’abord, nous montrons comment la méthode peut être appliquée pour quantifier la dégénérescence musculaire dans un modèle de mouche de dystrophie myotonique ; Deuxièmement, mesure de la surface transversale de muscle peut aider à identifier les gènes qui favoriser ou empêchent l’atrophie musculaire et/ou la dégénérescence musculaire ; en troisième lieu, le présent protocole peut être appliqué pour déterminer si un composé du candidat est en mesure de modifier de façon significative un phénotype donné d’atrophique induit par une mutation pathogèneou par un déclencheur de l’environnement.

Introduction

Le thorax de la mouche à fruit contient deux classes différentes de muscles du vol, qui sont distinctes sur le plan fonctionnel, anatomiquement et physiologiquement. Ces muscles sont : les muscles de vol indirect (IFM), qui sont composées de dorso-longitudinal (DLM) et muscles dorso-ventral (DVM) (Figure 1) et le vol synchrone contrôlent muscles^1,2. Ces muscles génèrent ensemble la puissance élevée requise pour vol. La taille, la distribution et la disposition rostro-caudal du SIFM permettent une orientation facile pour coupe transversale³ (Figure 2 a). Pour cette raison, nous avons sélectionné ces muscles pour étudier une atrophie musculaire chez Drosophila melanogaster.

Figure 1. Diagramme du thorax de la drosophile montrant les muscles de vol indirect (SIFM) arrangement. (À gauche) représente une vue latérale et (à droite) représente une coupe transversale du thorax. Le SIGF se composent des muscles Dorso-longitudinal (DLM) (en rouge) et le Dorso-ventral (DVM) les muscles (en vert).

Préservation de la structure des tissus et la maîtrise de l’orientation de l’axe dorso-ventral de coupes histologiques sont essentielles pour assurer une évaluation correcte des transversale du muscle. Afin de préserver la structure du muscle, nous avons utilisé un mélange de fixation adapté de Tomlinson et al. ⁴ . En outre, parce que les muscles sont les tissus internes, l’imperméabilité de l’exosquelette de drosophileest un problème comme la fixation des mélanges ne peut pas pénétrer dans les tissus de cible. Pour contourner ce problème, nous avons supprimé la tête de la mouche, les jambes, les ailes et les deux derniers segments de l’abdomen pour créer des trous qui ont permis le mélange de fixation entrer. Dans le cadre du protocole de fixation que nous comprenait un traitement avec le tétroxyde d’osmium (OsO₄)⁵, qui est largement utilisé en raison de sa capacité à fixer les graisses, y compris les triglycérides. OsO₄ conserve la plupart des structures extrêmement bien, surtout au niveau cytologique et en même temps offre un contraste de l’image. Après fixation, Drosophila thoraces ont été incorporés dans la résine pour transversale semi-mince sectionnement (1,5 µm). Pour un contraste amélioré, le tissu peut être plus coloré avec toluidine bleu. Images de thoraces complets ont été prises à 10 X et zone musculaire a été quantifié par binarizing des images (de dimensions égales) et de quantifier le pourcentage de pixels correspondant au tissu musculaire (pixels noirs) sur total, avec les logiciels ImageJ.

Modification sur les mélanges de préparation et de la fixation de tissu, comme l’augmentation de la concentration de la solution₄ et glutaraldéhyde OsO, a présenté dans le présent protocole, autorisée unique préservation du tissu musculaire. C’est parce que le protocole permet d’éviter la dégradation et la déformation des tissus, rendant l’analyse postérieure des échantillons plus fiables même dans des conditions très atrophiques associées à des maladies dégénératives neuromusculaires comme la dystrophie myotonique (DM). Dans sa forme la plus commune, DM de type 1, cette maladie génétique rare est provoquée par élargi CUG répétitions dans les transcriptions de la protéine kinase de la dystrophie myotonique (HEPATO). Mutant HEPATO RNA regroupe des foyers de ribonuclear forme qui séquestrent les protéines de liaison à l’ARN nucléaires comme Muscleblind (MBNL1-3 ; MUSCLEBLIND (Mbl) chez la drosophile)⁶. Nous avons généré un modèle drosophile de dystrophie myotonique en exprimant 250 répétitions CTG sous le promoteur de la chaîne lourde de myosine musculaire (Mhc-Gal4). Les mouches de modèle ont été incapables de voler avec un phénotype typique « qui s’est tenue vers le haut les ailes » et avaient musculaire grave atrophie dans leur SIFM (Figure 2 b). Des études antérieures effectuées dans notre laboratoire ont montré que la détermination de l’aire de muscle du SIGF est une méthode fiable pour quantifier les effets de différents modificateurs chimiques ou génétiques de l’atrophie musculaire dans ces mouches de type⁷. Ainsi, la surexpression de la Mbl isoforme C chez les mouches exprimant la CTG 250 se répète dans le muscle, atteint un sauvetage de la zone de muscle, comme Mbl épuisement par séquestration est le facteur déclenchant en DM1 pathogenèse⁸ (Figure 2). Zone de muscle a été également secouru après que alimentant le modèle DM vole avec Abp1, un hexapeptide avec anti-DM1 éprouvée activité⁹ (Figure 2D).

Figure 2. Quantification des sections dorsoventral de thoraces adultes enrobées dans la résine. Muscles de vol Indirect (A-D) de Drosophila melanogaster avec les génotypes pertinentes indiquées. (A) contrôle les mouches (yw). (B) l’expression de 250 non-codantes CTG se répète dans le muscle (UAS-CTG(250)x) a entraîné une réduction de la zone musculaire DLMs comparativement aux mouches de contrôle. (C) ce phénotype d’atrophie musculaire a été secouru par la surexpression de la Muscleblind (MblC) (SAMU-CTG (250) x SAMU-MblC) et (D) alimentant les mouches de modèle avec l’hexapeptide Abp1 (SAMU-CTG (250) x Abp1). Dans toutes les images, la face dorsale est sur le dessus. Transgènes ont été conduits à la musculaire à l’aide d’un promoteur de chaîne lourde de myosine (Mhc)-Gal4. (E) quantification du pourcentage de la surface du muscle par rapport à le mouches de contrôle a confirmé que les différences étaient significatives. L’histogramme montre moyen ± S.E.M. **p< 0,01 et * p < 0,05 (Student´s t-test). Echelle : 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La méthode mentionnée ici sera d’intérêt pour les chercheurs en se concentrant sur le développement musculaire, entretien et vieillissement, la maladie et le dépistage des drogues car il fournit des informations fiables sur comment le tissu musculaire répond à des facteurs endogènes et externes.

Protocol

1. fixation et résine enrobage Anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone (CO2) ou par hypothermie en utilisant un bloc de glace. Utiliser un microscope à dissection (avec faible grossissement de voir la volée entière) et des ciseaux pour enlever les pattes, ailes, tête et la partie terminale de l’abdomen pour faciliter la pénétration du fixateur. Une manipulation soigneuse des carcasses est nécessaire à cette étape afin d’éviter la déformation du thorax.Remarque : Comme…

Representative Results

Afin de quantifier si la surexpression de MblC ou l’administration d’Abp1 avait eu aucun effet dans le phénotype atrophique du modèle mouche dystrophie myotonique, nous nous sommes concentrés sur les DLMs, qui font partie du SIFM (Figure 1). Nous avons déterminé que le modèle vole, qui expriment 250 non codantes CTG répétitions tout au long de la musculature entraînée par le promoteur de la chaîne lourde de la myosine (Mhc)-Gal4, prés…

Discussion

Il a été démontré que les Drosophila melanogaster est un modèle utile pour étudier les maladies neuromusculaires humaines^7,10,11, y compris la dystrophie myotonique, qui se caractérisent par l’apparition de atrophie musculaire. Le protocole présenté ici est un outil utile pour quantifier la dégénérescence musculaire causée par l’apparition ou la progression d’une maladie particulière à un modèle de…

Materials

Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.