Determinazione di zona ottico della sezione trasversale del muscolo dei muscoli adulto volo indiretto di Drosophila Melanogaster
Summary
Segnaliamo un metodo per quantificare l’area del muscolo, che è un metodo indiretto per determinare la massa muscolare in Drosophila adulti. Dimostriamo che l’applicazione della nostra metodologia analizzando il volo indiretto i muscoli in un modello di Drosophila di malattia di Steinert.
Abstract
Massa del muscolo che spreca, conosciuta come atrofia muscolare, è un fenotipo comune in Drosophila modelli di malattie neuromuscolari. Abbiamo usato i muscoli di volo indiretto (IFM) di mosche, in particolare i muscoli dorso-longitudinale (DLM), come lo sperimentale oggetto di misura il fenotipo atrofico causato da diverse cause genetiche. In questo protocollo, descriviamo come incorporare i muscoli del torace volare per il taglio sottile di semi, come ottenere un buon contrasto fra il muscolo ed il tessuto circostante e come elaborare immagini al microscopio ottico per acquisizione semiautomatica di dati quantificabili e analisi. Descriviamo tre applicazioni specifiche della pipeline metodologica. In primo luogo, ci mostra come il metodo può essere applicato per quantificare la degenerazione muscolare in un modello di distrofia myotonic fly; in secondo luogo, la misurazione della sezione trasversale del muscolo può aiutare a identificare i geni che possono promuovono o impediscono l’atrofia del muscolo e/o degenerazione del muscolo; in terzo luogo, questo protocollo può essere applicato per determinare se un candidato composto è in grado di modificare in modo significativo un determinato fenotipo atrofico indotto da una mutazione malattia-causanteo da un innesco ambientale.
Introduction
Il torace del moscerino della frutta contiene due diverse classi di muscoli di volo, che sono funzionalmente, fisiologicamente e anatomicamente distinti. Questi muscoli sono: i muscoli di volo indiretto (IFM), che sono composte di dorso-longitudinale (DLM) e muscoli del dorso-ventrale (DVM) (Figura 1) e il volo sincrono controllano muscoli1,2. Questi muscoli generano insieme l’elevata potenza meccanica necessaria per il volo. La dimensione, la distribuzione e la disposizione rostro-caudale dell’IFMs permettono un agevole orientamento per sezionamento trasversale3 (Figura 2A). Per questo motivo, abbiamo selezionato questi muscoli per studiare l’atrofia del muscolo in Drosophila melanogaster.
Figura 1. Diagramma del torace del moscerino della frutta che mostra i muscoli di volo indiretto (IFM) disposizione. (A sinistra) rappresenta una vista laterale e (a destra) rappresenta una sezione trasversale del torace. L’IFM sono composti da dei muscoli del Dorso-longitudinale (DLM) (in rosso) e il Dorso-ventrale (DVM) muscoli (in verde).
Conservazione della struttura del tessuto e il controllo sull’orientamento dell’asse dorso-ventrale delle sezioni istologiche sono fondamentali per garantire la corretta valutazione della sezione trasversale del muscolo. Per preservare la struttura del muscolo, che abbiamo usato una miscela di fissazione per l’ultima volta da Tomlinson et al. 4 . Inoltre, perché i muscoli sono tessuti interni, l’impermeabilità dell’esoscheletro di Drosophilaè un problema come fissazione miscele non possono penetrare i tessuti di destinazione. Per aggirare questo problema, abbiamo rimosso la testa di Mosca, gambe, ali e gli ultimi due segmenti dell’addome per creare fori che ha permesso la miscela di fissazione entrare. Come parte del protocollo fissazione che abbiamo incluso trattamento con tetrossido di osmio (OsO4)5, che è ampiamente utilizzato per la sua capacità di fissare i grassi, compreso i trigliceridi. OsO4 conserva la maggior parte delle strutture estremamente bene, soprattutto a livello citologico e allo stesso tempo fornisce il contrasto dell’immagine. Dopo la fissazione, thoraces di Drosophila sono stati incorporati in resina per trasversale semi-sottile taglio (1,5 µm). Per migliorare il contrasto, il tessuto può essere inoltre macchiato con toluidina blu. Immagini di thoraces completo sono state scattate a 10x e area del muscolo è stato quantificato dal binarizing immagini (di uguali dimensioni) e quantificare la percentuale di pixel corrispondenti al tessuto muscolare (pixel neri) su totale, con il software ImageJ.
Le modifiche sulle miscele preparazione e la fissazione di tessuto, come l’aumento della concentrazione della soluzione4 e glutaraldeide OsO, introdotto nel presente protocollo, hanno permesso unico di conservazione del tessuto muscolare. Questo è perché il protocollo evita la degradazione e la deformazione del tessuto, rendendo l’analisi posteriore dei campioni più affidabile anche in condizioni altamente atrofiche associate a malattie degenerative neuromuscolari come la distrofia miotonica (DM). Nella sua forma più comune, DM di tipo 1, questo raro disordine genetico è causato da ripetizioni CUG ampliate in trascrizioni di chinasi di proteina di distrofia myotonic (DMPK). Mutante DMPK RNA aggrega i fuochi di ribonuclear forma che sequestrano le proteine nucleari di RNA-binding Muscleblind-come (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) in Drosophila)6. Abbiamo generato un modello di Drosophila della distrofia Myotonic esprimendo 250 ripetizioni CTG sotto il promotore di catena pesante della miosina muscolare (Mhc-Gal4). Modello mosche erano incapaci di volare con un fenotipo tipico ‘tenuto fino ali’ e muscolare grave atrofia nella loro IFMs (Figura 2B). Precedenti studi condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che la determinazione dell’area muscolare di IFM è un metodo affidabile per quantificare gli effetti di diversi modificatori chimici o genetici dell’atrofia muscolare in queste mosche modello7. Ad esempio, sovraespressione di Mbl isoforma C in mosche esprimendo il CTG 250 si ripete nel muscolo, raggiunto un salvataggio di area del muscolo, come lo svuotamento di Mbl dal sequestro è il fattore scatenante nella DM1 patogenesi8 (Figura 2). Area del muscolo è stato anche salvato dopo il modello DM d’alimentazione Vola con Abp1, un esapeptide con anti-DM1 comprovata attività9 (Figura 2D).
Figura 2. Quantificazione delle sezioni dorsoventral di resina-incastonato thoraces adulto. i muscoli di volo indiretto (A-D) di Drosophila melanogaster con i genotipi pertinenti indicati. (A) controllo vola (yw). (B) espressione di 250 non codificante CTG si ripete nel muscolo (UAS-CTG(250)x) ha causato una riduzione dell’area di muscolo DLMs rispetto al controllo mosche. (C) questo fenotipo di atrofia del muscolo è stato salvato da sovraespressione di Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) e (D) alimentazione le mosche di modello con l’esapeptide Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). In tutte le immagini la parte dorsale è sulla parte superiore. Transgeni sono stati guidati al muscolo utilizzando un promotore di catene pesanti della miosina (Mhc)-Gal4. (E) quantificazione della percentuale di area muscolare rispetto le mosche di controllo ha confermato che le differenze erano significative. L’istogramma mostra mezzi ± s.e.m. * *p< 0.01 e * p < 0.05 (test t dello studente). Barra della scala: 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il metodo qui segnalato sarà di interesse per i ricercatori concentrandosi sullo sviluppo muscolare, manutenzione e invecchiamento, patologia di malattia e test anti-droga in quanto fornisce informazioni affidabili sulla risposta ai fattori sia endogeni che esterni tessuto muscolare.
Protocol
Representative Results
Discussion
È stato dimostrato che la Drosophila melanogaster è un modello utile per studiare le malattie neuromuscolari umano7,10,11, compreso Distrofie Miotoniche, che sono caratterizzate dalla comparsa di atrofia muscolare. Il protocollo presentato qui è un utile strumento per quantificare la degenerazione muscolare causata dall’insorgenza o la progressione di una particolare malattia in un modello fly. Ad esempio, è anche p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare i membri del gruppo di genomica traslazionale e Kathryn J Hanson per il feed-back e i miglioramenti su questo protocollo. Questo progetto è stato effettuato con assegno di ricerca SAF2015-64500-R, che comprende fondi europei di sviluppo regionale, assegnato a r. a dal Ministerio de Economia y Competitividad.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
Riferimenti
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